糖尿病肾病患者血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平与病情进展的关系

吴多培,杨佳玲,陈文玉,贾 莉△

陵水黎族自治县人民医院:1.血液透析科;2.肾内科,海南陵水 572400

糖尿病肾病(DN)是由糖尿病引起的慢性肾脏疾病(CKD),相较于未合并CKD的糖尿病患者,DN患者病死率明显增加[1-2]。DN的发病和进展机制复杂,揭示DN发病的分子和进展机制对DN的早期诊断和治疗意义重大。非编码RNA是一类不能翻译为蛋白质的RNA,包括长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)等,能通过调节炎症、纤维化、细胞增殖、凋亡、焦亡、自噬等过程参与DN发生、发展[3]。核丰富转录本1(NEAT1)是新发现的一种lncRNA,有研究报道下调lncRNA NEAT1能抑制DN细胞增殖、纤维化、炎症反应[4]。另有研究报道,上调miR-23c能抑制DN炎症反应和细胞焦亡[5]。本研究旨在分析血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平与DN和病情进展的关系,以期探讨DN疾病进展的内在分子机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 将本院2019年5月至2020年5月收治的136例DN患者纳入研究作为DN组,其中男73例、女63例,年龄(54.50±7.77)岁,病程(5.83±1.18)年。纳入标准:(1)DN的诊断符合《中国糖尿病肾脏疾病防治临床指南》中DN的诊断标准[6];(2)年龄≥18岁;(3)临床资料完整。排除标准:(1)近6个月接受过免疫抑制剂、激素治疗;(2)近3个月患急性感染或急性心、脑血管疾病;(3)合并甲状腺、甲状旁腺或肾上腺等其他内分泌器官的疾病;(4)合并免疫、血液系统疾病;(5)恶性肿瘤;(6)合并高血压肾损害、膜性肾病、肾病综合征或系膜增生性肾小球肾炎等其他肾脏疾病。另选取同期于本院体检的58例健康者作为对照组,其中男26例、女32例,年龄(53.45±7.26)岁。两组性别构成、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。纳入研究者及其直系亲属均对本研究知情同意并签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1临床实验室指标的检测 DN组和对照组分别于入院次日和体检当日清晨(禁食8 h后)接受空腹静脉血标本采集。采用美国贝克曼库尔特DXC800型全自动生化分析仪测定空腹血糖(FBG)、血脂四项[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN);根据简化MRDR公式计算估算的肾小球滤过率(eGFR),eGFR=[186×Scr(mg/dL)]-(1.154×年龄)-0.203,若为女性,则需将计算结果再乘以0.742。收集受检者24 h尿液,采用放射免疫分析法检测尿清蛋白和肌酐水平,计算尿清蛋白/肌酐比值(UACR)。

1.2.2实时荧光定量PCR(qPCR)检测 采集受试者6 mL空腹静脉血,以3 000 r/min离心10 min(离心半径为8 cm),取上清液,立即保存于-80 ℃冰箱备用。采用TRIzol试剂盒提取血清总RNA,验证RNA浓度和纯度[260 nm和280 nm处吸光度(A)比值(A260/A280)为1.8～2.0]后,使用Takara反转录试剂盒转录合成cDNA,SYBR Green Master Mix qPCR试剂盒检测血清lncRNA NEAT1、miR-23c、肾损伤分子-1(KIM-1)mRNA、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)mRNA、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA、白细胞介素-6(IL-6)mRNA水平。lncRNA NEAT1、miR-23c的检测以U6作为内参;KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6的检测以GAPDH作为内参。引物序列见表1。反应体系共20 μL:1 μL cDNA,2 μL正/反向引物,10 μL SYBR Green Master Mix、5 μL ddH2O。反应条件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 15 s、62 ℃ 40 s共40个循环。2-ΔΔCt法计算血清lncRNA NEAT1、miR-23c、KIM-1 mRNA、NGAL mRNA、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA相对表达量。

表1 qPCR引物序列(5′-3′)

1.2.3CKD分期 DN患者入院后参考《中国糖尿病肾脏疾病防治临床指南》[6],根据有无肾脏损害(包括病理异常、影像学异常、血尿、其他尿沉渣异常、UACR≥30 mg/g等)和eGFR进行CKD分期。G1期:有肾脏损害,eGFR≥90 mL·min-1·1.73 m-2;G2期:有肾脏损害,eGFR为60～<90 mL·min-1·1.73 m-2;G3期:有或无肾脏损害,eGFR为30～<60 mL·min-1·1.73 m-2;G4期:有或无肾脏损害,eGFR为15～<30 mL·min-1·1.73 m-2;G5期:有或无肾脏损害,eGFR<15 mL·min-1·1.73 m-2或透析。根据CKD分期将DN患者分为G1期(34例)、G2期(26例)、G3期(36例)、G4期(22例)、G5期(18例)。

2 结 果

2.1两组临床实验室检测指标比较 DN组FBG、TC、TG、LDL-C、Scr、BUN、UACR水平均高于对照组,HDL-C水平低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 两组临床实验室检测指标比较或M(P25,P75)]

2.2两组血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平比较 DN组血清lncRNA NEAT1水平高于对照组,miR-23c水平低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 两组血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平比较

2.3两组血清KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平和eGFR比较 DN组KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平均高于对照组,eGFR低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表4。

表4 两组血清KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平及eGFR比较或M(P25,P75)]

2.4不同CKD分期DN患者血清lncRNA NEAT1、miR-23c和KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平比较 G1～G5期DN患者血清lncRNA NEAT1和KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平依次升高,miR-23c水平依次降低,差异均有统计学意义(P<0.05),见表5。

表5 不同CKD分期DN患者血清lncRNA NEAT1、miR-23c和KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平比较

表6 DN患者血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平与KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平及eGFR的相关性

2.5DN患者血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平与KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平及eGFR的相关性 Pearson/Spearman相关分析显示,DN患者血清lncRNA NEAT1水平与KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平均呈正相关(P<0.05),与miR-23c、eGFR呈负相关(P<0.05)。DN患者血清miR-23c水平与KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平均呈负相关(P<0.05),与eGFR呈正相关(P<0.05)。见表6。

2.6血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平与DN病情进展的关系 以血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平为自变量,CKD分期为因变量(G1～G5期分别赋值为1、2、3、4、5),建立未校正、校正血糖后(用FBG进行校正)、校正血糖和血脂后(用FBG、TC、TG、HDL-C、LDL-C进行校正)、校正血糖、血脂、肾功能后(用FBG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、Scr、BUN、UACR进行校正)4种多元有序Logistic回归模型,平行线检验均P>0.05,满足平行线假设。结果显示,校正血糖、血脂、肾功能后,lncRNA NEAT1仍然是DN病情进展的独立危险因素,miR-23c是独立保护因素(P<0.05)。见表7。

表7 血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平作为DN病情影响因素的多元有序Logistic回归分析

3 讨 论

糖尿病是危害人类健康的重大疾病之一,2019年全球20～79岁人群患病人数达4.63亿[7]。DN是糖尿病常见微血管并发症之一,临床特征为持续清蛋白尿排泄增加和(或)GFR进行性下降,最终可发展为终末期肾脏疾病,严重威胁人类生命健康[8-9]。DN的主要病理生理改变包括肾小球/肾小管基底膜增厚、肾小球硬化、肾小管萎缩和细胞凋亡、肾间质炎症浸润、肾间质纤维化等[10]。目前DN进展的机制尚不十分清楚,探讨DN进展的机制对DN的早期诊断和治疗意义重大。

lncRNA是一类由200个核苷酸构成的无蛋白质编码功能的RNA,广泛参与转录调节、转录后调节、表观遗传调节等基因表达的调控过程,其异常表达与DN等多种疾病有关。DUAN等[11]的研究报道,lncRNA干扰素刺激基因20能通过miR-486-5p/活化T细胞核因子5诱导蛋白激酶B磷酸化促进DN中的肾纤维化过程。lncRNA NEAT1定位于染色体11q13.1,最初的研究发现其主要通过稳定细胞核内miRNA调节基因表达,后来发现其在肿瘤发生、发展中也发挥重要作用。有研究显示,lncRNA NEAT1能促进肾癌细胞增殖、上皮-间质转化、侵袭、迁移[12-13]。肾间质炎症浸润、肾细胞凋亡、肾间质纤维化是DN的主要病理生理特征[10]。WANG等[14]的研究报道,lncRNA NEAT1能通过miR-27a-3p/活化激酶1结合蛋白3轴调控急性肾损伤炎症和细胞凋亡。LI等[15]研究报道,lncRNA NEAT1能靶向miR-129促进肾纤维化。本研究结果显示,DN组血清lncRNA NEAT1水平高于对照组,且G1～G5期DN患者血清lncRNA NEAT1水平依次升高,说明lncRNA NEAT1参与DN发生、发展,推测其作用机制可能为通过靶向miRNA促进肾脏炎症及肾间质纤维化。随着lncRNA NEAT1水平的升高,肾损伤程度更加严重[14-15]。KIM-1是一种跨膜糖蛋白,正常生理状态下表达极少,当肾脏出现缺血、炎症等损伤时其水平可快速升高;NGAL是一种脂质运载蛋白,正常生理状态下表达极少,当肾脏出现缺血、炎症等损伤时其水平可快速升高,并通过增强抗炎症反应发挥保护作用。目前KIM-1、NGAL已被认为是DN肾损伤的标志物[16]。有研究表明,DN是一种慢性低水平炎症疾病,TNF-α、IL-6等促炎症细胞因子通过刺激并损伤胰岛β细胞而诱发胰岛素抵抗,并且进一步介导DN的发生、发展过程[17-18]。肾功能改变为DN的重要表现,eGFR是反映肾功能的主要指标,目前CKD分期也是基于eGFR[6]。本研究结果显示,DN组血清KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平升高且随着CKD分期增加而升高,符合既往研究报道;进一步研究显示,DN患者血清lncRNA NEAT1与KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平呈正相关,而与eGFR呈负相关,说明lncRNA NEAT1参与DN发生、发展,推测其机制可能与lncRNA NEAT1能抑制蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信号通路促进DN肾细胞增殖和组织纤维化有关[19]。

miRNA是一种包含约22个核苷酸的无蛋白质编码功能的RNA,能通过结合靶基因3′非编码区,降解或抑制mRNA翻译,在转录水平上调节基因表达[3]。有研究表明,miRNA也广泛参与DN发生、发展,如miR-27a-3p能通过影响肾纤维化、线粒体功能障碍、内质网应激参与DN发生、发展[20]。miR-23c定位于染色体Xp22.12,既往研究报道了其在肿瘤中的作用,如miR-23c能通过调控染色质解旋酶DNA结合蛋白7影响子宫内膜癌细胞的恶性特征和预后[21]。目前有关miR-23c与肾脏疾病的研究报道较少,LU等[21]通过下一代测序分析发现,miR-23c为DN患者尿液差异表达miRNA之一,但未进一步分析miR-23c与DN的关系。本研究结果显示,DN组血清miR-23c水平低于对照组,而且G1～G5期DN患者血清miR-23c水平依次降低,说明miR-23c参与DN发生、发展。但LEE等[22]报道,DN患者尿液中miR-23c水平明显上调,而本研究中DN组血清miR-23c水平明显下调,考虑与DN患者肾功能恶化引起miR-23c渗漏至尿液有关,本研究后续也将进一步验证相关推论。本研究结果还显示,DN患者血清miR-23c与KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平呈负相关,而与eGFR呈正相关,进一步说明miR-23c参与DN发生、发展,推测其作用机制与低水平miR-23c会促进高糖诱导的DN细胞的焦亡,增加促炎因子IL-1β表达,加重肾损伤有关[5,23]。lncRNA能通过竞争胞内miRNA,抑制靶基因表达[24]。LI等[25]通过starBase生物信息学软件和双荧光素酶报告基因实验证实,lncRNA NEAT1可海绵化miR-23c,促进DN患者肾间质细胞增殖和纤维化。本研究结果也显示,DN患者血清lncRNA NEAT1与miR-23c水平呈负相关,说明二者共同参与DN病情进展,但二者在DN中发挥的具体作用,本课题组未进行深入探讨。本研究仅通过检测患者血清指标探讨了二者与DN病情进展的关系,并未通过肾穿刺获取组织标本来进行验证,可能对肾损伤的评估存在一定的偏差,后续本研究将进一步扩大样本量,通过收集肾穿刺组织标本进一步验证lncRNA NEAT1和miR-23c水平与DN肾损伤进展的关系,为探讨DN发展的内在机制提供参考,也为DN肾损伤早期评估提供依据。

DN发生与高血糖所致的糖代谢、脂代谢异常密切相关,合理控制血糖和血脂水平对延缓DN进展意义重大[10]。本研究中,DN患者血糖、血脂水平明显异常,同时肾功能指标Scr、BUN、UACR水平也明显升高。最后,本研究通过多元有序Logistic回归证实,无论是否校正血糖、血脂、肾功能指标,血清lncRNA NEAT1、miR-23c均是DN病情进展的独立影响因素,进一步说明二者与DN病情进展密切相关。

综上所述,DN患者血清lncRNA NEAT1水平提升,miR-23c水平降低,与DN病情进展密切相关。但本研究为初步研究,后续还需大样本量的研究证实得到的结论并进一步分析二者与DN病情进展的关系。