基于生物信息学筛选与铁死亡有关的非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药DEGs*

冯 英,郑 瑶,仇成凤,4,谭力铭△

1.徐州医科大学药学院,江苏徐州 221000;2.怀化市第二人民医院肿瘤防治怀化市重点实验室,湖南怀化 418000;3.吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南吉首 416000;4.湖南医药学院总医院循证医学与临床研究中心,湖南怀化 418000

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤,从癌细胞形态及病理角度将肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC),其中NSCLC占80%～85%[1]。表皮生长因子受体(EGFR)是NSCLC中最常见的驱动基因之一。酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)是治疗携带EGFR突变的局部晚期或转移性NSCLC患者的标准一线疗法[2]。本研究使用的GSE117846数据集主要聚焦第一代EGFR-TKIs。第一代EGFR-TKIs包括厄洛替尼和吉非替尼等,大多数EGFR突变的NSCLC患者在接受第一代EGFR-TKIs治疗9～13月后出现获得性耐药与疾病进展[3]。有研究表明,EGFR-TKIs耐药机制主要包括原发性耐药和获得性耐药,获得性耐药机制主要包括EGFR T790M突变、间质表皮转化因子(MET)扩增、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)突变等,其中EGFR T790M突变约占第一代EGFR-TKIs获得性耐药机制的50%～60%[4]。EGFR-TKIs获得性耐药是一个复杂的过程,目前其确切分子机制尚不清楚。铁死亡是一种铁依赖非凋亡性细胞死亡,本质上是膜脂质修复酶活性衰竭、细胞内脂质过氧化物代谢紊乱、铁依赖的脂质活性氧自由基积累导致的细胞死亡,与细胞凋亡、坏死、自噬在形态学、遗传学和生化特性上有明显区别,同时与癌症的发生、发展密切相关[5]。KUKULJ等[6]研究发现铁蛋白在NSCLC患者组织中普遍高表达,与肿瘤患者不良预后有关。相关研究表明,铁死亡还参与某些癌症耐药性的发生和逆转[7-8],调节铁死亡可以影响抗癌药物的疗效[9]。本研究通过生物信息学分析筛选出与EGFR-TKIs耐药相关的铁死亡基因,旨在寻找NSCLC潜在的干预靶点及生物标志物,为NSCLC EGFR-TKIs耐药基因表达综合数据库患者的治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1数据来源 在基因表达综合数据库(GEO)(https://www.ncbi.nlm.Nih.Gov/geo/)中下载基因表达谱数据集GSE117846。该数据集是在对耐药细胞进行不同处理后,获取的耐药细胞RNA-seq基因表达谱,技术平台为GPL21290:Illumina HiSeq 3000(Homo sapiens)。通过FerrDb数据库(http://www.zhounan.org/ferrdb)获取铁死亡相关基因,包括驱动基因(370个)、抑制基因(349个)及标记基因(12个),去除非人类基因和重复基因,最后得到382个基因。NSCLC患者的肿瘤组织与正常组织的基因表达数据均来自TCGA公共数据集(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/str-uctural-genomics/tcga),包括肺鳞癌(LUSC)患者肿瘤组织数据503例及正常组织数据52例、肺腺癌(LUAD)患者肿瘤组织数据515例及正常组织数据59例。

1.2方法

1.2.1DEGs筛选 通过GEO自带的基因差异分析工具(GEO2R)分析GSE117846数据集中的DEGs,以P<0.05且|log2FC|≥1为筛选条件,FC表示变化倍数。利用在线工具jvenn(https://www.bioinformatics.com.cn)将从GSE117846数据集筛选出的DEGs及从FerrDb数据库获取的铁死亡相关基因构建Venn图,得到与铁死亡相关的NSCLC EGFR-TKIs耐药DEGs。

1.2.2DEGs的功能和通路分析 使用在线工具DAVID 2021(https:// david.ncifcrf.Gov/)进行DEGs的功能和通路分析,导入并查看DEGs的基因本体论(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析结果。

1.2.3蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建 将交集基因导入STRING 11.5 (https://string-db.org/)数据库分析PPI,并利用CytoScape3.9.1中cytoHubba插件的最大邻域分量(MNC)、最大团中心性(MCC)、边缘渗透分量(EPC)和最大邻域分量的密度(DMNC)4种算法筛选出交集基因中的关键基因(Hub基因)。

1.2.4表达差异和生存分析 利用ULCAN数据库对Hub基因在NSCLC肿瘤组织和正常组织中的表达水平进行差异分析。同时,利用GEPIA2数据库比较Hub基因表达水平在NSCLC不同分期间的差异,并绘制不同Hub基因表达水平NSCLC患者的生存曲线(以Hub基因的中位表达水平作为判断表达水平高低的临界值,以累积生存率作为统计指标。

1.2.5NSCLC组织来源和实时荧光定量PCR(qPCR)检测 5对NSCLC组织及癌旁组织取自2021年怀化市第二人民医院经病理学检查确诊的NSCLC患者手术切除组织。所有标本置于-80 ℃冷藏保存。本研究得到了怀化市第二人民医院伦理审查委员会的批准。使用TRI试剂(Sigma公司)分别从组织样品中提取总RNA,用Maxima H Minus第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)合成cDNA,最终反应体积为20 μL。根据试剂盒说明,进行qPCR检测。肿瘤蛋白P63(TP63)和内参基因GAPDH的引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。qPCR扩增条件为50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min共40次循环,实验重复3次。TP63的相对表达水平用2-ΔΔCt法进行计算。引物序列见表1。

表1 qPCR检测的引物序列

1.2.6体外细胞实验 将人肺癌细胞PC-9和对吉非替尼耐药的PC-9/GR细胞用于体外细胞实验,实验分组处理情况如下。PC-9组:作为对照,PC-9细胞培养基中加入DMSO;PC-9+吉非替尼组:PC-9细胞培养基中加入终浓度为1 μmol/L的吉非替尼处理24 h;PC-9/GR组:PC-9/GR细胞培养基中加入终浓度为1 μmol/L的吉非替尼处理48 h。细胞分组处理完成后,去除细胞培养基,用PBS洗2遍。参考1.2.5中的方法检测细胞中TP63的相对表达水平,实验重复3次。

2 结 果

2.1NSCLC EGFR-TKIs耐药的DEGs筛选 对GSE117846数据集中的6例样本表达数据进行差异分析,筛选符合P<0.05且|log2FC|≥1 的DEGs,最终得到3 716个差异基因,其中有1 744个上调基因和1 972个下调基因,见图1。

注:A为EGFR-TKIs耐药DEGs火山图,蓝色圆点代表表达下调的DEGs,粉色圆点代表表达上调的DEGs,灰色圆点代表表达无明显差异的基因;B为EGFR-TKIs耐药DEGs热图,对照组加入DMSO,实验组加入吉非替尼,红色表示上调,蓝色表示下调,ctrl.1～3表示对照组1～3号样本,gefi.1～3表示实验组1～3号样本。

2.2筛选与NSCLC EGFR-TKIs耐药及铁死亡相关的DEGs 通过FerrDb数据库获得铁死亡相关的基因共382个,与GSE117846数据集筛选所得的耐药相关的DEGs取交集,得到60个与铁死亡相关的NSCLC EGFR-TKIs耐药DEGs,包括30个下调基因和30个上调基因。见图2。

图2 NSCLC EGFR-TKIs耐药相关基因与铁死亡相关基因交集图

2.3GO功能和KEGG通路富集分析 对60个交集基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,以P<0.05为差异有统计学意义,结果显示与铁死亡相关的NSCLC EGFR-TKIs耐药DEGs主要富集的生物过程(BP)包括蛋白质ADP-核糖基化、p53类介质对DNA损伤的内在凋亡信号通路、细胞对氧化应激的反应等,主要富集的细胞成分(CC)为细胞质基质、细胞核、核小体、线粒体、细胞质等,主要富集的分子功能(MF)为蛋白ADP-核糖转移酶活性、NAD+ADP-核糖基转移酶活性和核苷酸转移酶活性等。GO功能富集分析主要显示了BP、CC和MF中10种富集最明显的途径(根据调整后的P值排名),见图3A。KEGG通路富集分析显示,与铁死亡相关的NSCLC EGFR-TKIs耐药DEGs主要参与铁死亡、P53信号通路、FoxO信号通路等,同时也在肝细胞癌及癌症中微小核糖核酸(miRNA)的相关调控中发挥作用,见图3B。

注:A为GO功能分析;B为KEGG通路富集分析。

2.4PPI网络构建 利用STRING数据库构建与铁死亡相关的NSCLC EGFR-TKIs耐药DEGs的PPI网络,选择综合得分≥0.4的基因进行PPI构建。隐藏没有相互作用的节点,最终得到共有57个节点和99条边的PPI网络,平均局部聚类系数0.377,PPI富集P<0.01,见图4A。将STRING结果导入Cytoscape软件,通过cytoHubba插件中的“MNC”“MCC”“EPC”和“DMNC”4种算法计算评分位于前10的基因,再利用jvenn筛选交集得到TP63基因,见图4B。

注:A为交集基因的PPI网络分析;B为Hub基因的筛选。

2.5Hub基因TP63的表达分析 ULCAN数据库分析显示,在LUAD组织中TP63表达水平明显低于正常组织(P<0.01),见图5A;在LUSC组织中TP63表达水平明显高于正常组织(P<0.01),见图5B。组织qPCR检测显示,与癌旁组织相比,TP63 mRNA在LUAD中低表达,在LUSC中高表达,差异均有统计学意义(P<0.05),与ULCAN数据库分析得到的结果一致,见图5C。GEPIA2数据库分析显示,TP63表达水平在不同分期NSCLC间比较,差异有统计学意义(F=5.04,P<0.01),见图5D。

注:TPM表示每百万个转录片段;A、B分别为TP63基因在NSCLC、LUAD、LUSC组织和癌旁组织中的表达水平,红色为LUAD或LUSC组织,蓝色为癌旁组织;C为TP63在不同NSCLC组织中的相对表达水平,与癌旁组织比较,**P<0.01,*P<0.5;D为TP63在NSCLC不同分期中的表达情况。

2.6不同TP63表达水平NSCLC患者的生存分析 GEPIA2数据库分析显示,TP63高表达组(235例)、低表达组(239例)LUAD患者生存预后比较,差异无统计学意义(P>0.05),见图6A;TP63低表达组(241例)的LUSC患者生存预后较高表达组(241例)差,Log-rankχ2检验P<0.05,见图6B。

注:A为TP63高/低表达的LUAD患者的生存曲线;B为TP63高/低表达的LUSC患者的生存曲线。

2.7体外细胞实验 PC-9组TP63 mRNA相对表达水平(1.01±0.01)高于PC-9/GR组(0.05±0.01)和PC-9+吉非替尼组(0.16±0.05),差异均有统计学意义(P<0.001),与GSE117846数据库分析的结果具有一致性。见图7。

注:与PC-9组比较,***P<0.001;ns.表示两组间比较差异无统计学意义。

3 讨 论

目前,EGFR-TKIs是治疗携带EGFR突变的局部晚期或转移性NSCLC患者的标准一线疗法[2]。然而,大多数EGFR突变的NSCLC患者在接受第一代EGFR-TKIs治疗9～13个月后,会出现获得性耐药,促进疾病进展[3]。有研究表明,铁死亡参与NSCLC EGFR-TKIs耐药[10-11],但铁死亡在EGFR-TKIs耐药中的具体机制尚不清楚,靶向铁死亡或许能为NSCLC EGFR-TKIs耐药干预提供新的思路。因此,本研究主要通过生物信息学分析挖掘NSCLC EGFR-TKIs耐药有关DEGs中与铁死亡相关的潜在靶基因,为EGFR-TKIs获得性耐药的干预提供新的思路。

本研究从NSCLC EGFR-TKI耐药数据集GSE117846和FerrDb数据库中筛选得到TP63,而且在体外细胞实验中发现TP63 mRNA 表达在PC9/GR细胞中下调,与生物信息学分析结果一致。初步推断TP63为NSCLC EGFR-TKIs耐药相关DEGs中与铁死亡相关的基因,但TP63在NSCLC EGFR-TKIs耐药与铁死亡中的作用需要进一步进行细胞功能实验确定。TP63是P53转录因子家族的成员,其结构与序列与P53高度同源[12]。TP63因为启动子的不同和3’端剪切方式的不同,可选择性剪接产生具有不同活性的亚型,根据TP63 N端转录来源的不同,可分为两种类型:较长TA异构体和较短DN异构体(DNp63和TAp63)。有研究表明,TP63在肿瘤中的作用比较复杂,主要是由于TP63的两种异构体TAp63和ΔNp63亚型在癌症中起相反的作用[13]。相关研究发现,TP63在食管鳞癌、膀胱癌、宫颈癌、头颈部鳞状细胞癌等癌症中发挥抑癌或促癌作用[14-15]。TIOFACK等[16]研究表明,TP63基因多态性可增加乳腺癌发生的风险。TP63与上皮恶性肿瘤高度相关,尤其是鳞状细胞癌[12,17]。同时,有研究表明,ΔNp63的异常表达与药物的耐药性有关,ΔNp63的异常表达会影响食道鳞状细胞癌、乳腺癌等的化疗效果[18-20]。此外,GALOZZOVA等[12]发现EGFR信号通路可能具有调控ΔNp63激活和表达的作用。目前,TP63在NSCLC EGFR-TKIs耐药领域的研究较少,大部分是吉非替尼与TP63相关性的研究[21-22],而且吉非替尼耐药与TP63表达之间相关性的研究结果不完全相同。杨颖等[23]的研究报道,TP63可能与PC9细胞耐药有关,而且在PC9/GR细胞中高表达并发挥ΔNp63的促癌特性。本研究结果显示,TP63的表达与PC9细胞耐药有关,但TP63在PC9/GR细胞中mRNA表达下调。造成研究结果冲突的原因可能与TP63的多种亚型结构相关,具体机制需要进一步探究。

铁在决定细胞命运的内稳态调节和疾病中起着重要作用,当铁代谢失调时,会增加患者患癌的风险[24]。相关研究表明,EGFR可以通过铁蛋白的再分配破坏铁的稳态,促进肺癌的发展[25]。本研究中与铁死亡相关的NSCLC EGFR-TKIs耐药的GO功能和KEGG通路富集多在氧化应激反应、P53类介质对DNA损伤的内在凋亡信号通路、铁死亡和肝细胞癌等方面。已有研究表明,ΔNp63α可通过调节谷胱甘肽的合成、利用和再生,增加细胞对氧化应激和铁死亡的抵抗力[26]。同时,WANG[26]等证明了ΔNp63α过表达可保护细胞免受氧化剂、DNA损伤、失巢凋亡或铁死亡诱导剂诱导的氧化应激损伤。WANG等[18]研究发现,在耐铂卵巢癌细胞中卷曲类受体7(FZD7)的过表达可以激活致癌因子TP63,驱动谷胱甘肽代谢途径的上调,保护细胞免受化疗诱导的氧化应激,促进卵巢癌发展。GUO等[27]研究发现,在胃癌中下调FZD7可进一步抑制由TP63表达下调介导的GPX4诱导的铁死亡。以上研究显示,TP63可能是连接氧化应激-铁死亡的主要基因,其可能影响NSCLC的发生、发展以及第一代EGFR-TKIs疗效。但TP63的相关功能与分子机制仍需要大量基础实验进行研究和验证。

综上所述,本研究基于生物信息学分析筛选得到与铁死亡相关的NSCLC EGFR-TKIs耐药DEG基因为TP63,并且对这一结果进行了初步的实验验证,发现TP63对NSCLC的预后评估具有一定的价值,可作为EGFR-TKIs耐药相关铁死亡的治疗靶点和LUSC预后生物标志物。然而,本研究仍存在一些局限性:一方面,GSE117846数据集中的EGFR-TKIs耐药病例和人体组织样本较少,本研究筛选的Hub基因还需在后续研究中通过扩大样本量进一步验证。另一方面,本研究仅筛选到TP63基因,并富集了一些可能的信号通路。但TP63具有多种亚型结构,本研究推测TP63参与了NSCLC中与EGFR-TKIs耐药相关的铁死亡,其具体的分子机制和信号通路尚不清楚,有待后续研究中进一步探索。