缝隙介导干细胞治疗缺血性卒中的研究进展

杨艾琳 刘长兴 王金仙 郑艳 常翔

卒中发病率的增加与人口老龄化的加剧,给全世界带来了巨大的社会和经济负担[1]。缺血性卒中(ischemic stroke,IS)占卒中主要类型的87%[2],目前临床上针对卒中的血栓溶解治疗与血管内机械取栓治疗都受到严格的时间窗限制[3],且患者在治疗后多遗留各种神经功能缺损症状[4],这对卒中幸存者后续的工作与生活造成了严重困扰。因此,临床上需要探索一种有效且治疗时间窗宽的治疗方法。随着干细胞研究的发展,细胞治疗已经成为IS治疗的新策略,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)、神经干细胞(neural stem cells,NSCs)以及胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)通过缝隙连接(gap junction,GJ)的细胞-细胞相互作用是治疗IS的关键机制。本文就上述类型的干细胞通过GJ介导治疗IS的研究进展作一综述,以期为该病的临床治疗提供新的思路。

1 IS

IS是由于栓子或血栓导致供血动脉闭塞,缺血、缺氧所致的局限性脑组织坏死或软化。在IS的发病机制中,脑血管栓塞是IS发生的主要诱因,表现为暂时性的脑组织缺血,导致氧气和营养物质输送不足,从而引发脑组织损伤。脑血流量的减少会给卒中患者带来一系列的不良后果,这是目前公认的观点[5-6]。脑内持续的氧气和葡萄糖供应是产生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)和维持神经细胞跨膜梯度所必需的条件。由IS带来的大脑中缺氧和葡萄糖缺乏,引发了一些细胞和分子反应,它的中断导致突触前终末的缺氧性去极化[7],扰乱了神经元和神经胶质的功能,这些事件进一步启动了细胞死亡的级联反应,包括细胞凋亡、坏死和自噬[8]。随后,血脑屏障被破坏,外周炎性细胞进入脑实质[9],并通过释放促炎细胞因子,进一步加重神经功能障碍[10]。

2 干细胞疗法与缝隙连接

干细胞疗法以MSCs、HSCs、NSCs和ESCs为主要细胞来源[11],可能通过分泌各种神经营养因子,如脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),并代替受损神经元来实现神经保护和修复。组织再生过程中广泛的细胞-细胞通信是通过细胞外ATP的嘌呤能信号来协调的,这种通信的ATP释放是由连接蛋白(connexin,Cx)和其形成的半通道介导的。

GJ是由Cx的半通道组成的亲水性通道,每个Cx位于相邻细胞的膜上,这种细胞膜通道有助于相邻细胞间小分子和小代谢物的直接交换[12]。这些通道在神经元的分化、维持、存活和功能中起着重要作用,由于其在干细胞整合、损伤和髓鞘再生中发挥作用,GJ成为神经再生医学很有前景的治疗靶点[13]。研究发现,GJ直接连接相邻细胞的细胞质,其连接通道允许离子和代谢物等小分子在细胞内根据它们在细胞之间的浓度梯度进行双向交换[14],其中以葡萄糖最具代表性,它们可以被移植的干细胞通过GJ转移到细胞-细胞间进行相互作用,因此,干细胞疗法的研究需要深入了解细胞-细胞间通讯在其中发挥的积极作用。

3 MSCs

3.1 细胞来源与作用机制 MSCs是一种多能的非造血细胞群体,在许多器官的组织中都有发现,比如骨髓、脂肪组织、骨骼肌组织、肺组织、心脏、脐带血以及内皮细胞[15]。除了广泛可及性,MSCs还可以定位到损伤部位,且具有不需要基因匹配的“免疫特权”[16],在过去20年的研究里已经证明移植MSCs是安全的[17],针对IS发生后的康复是有效的[18],这些优点使MSCs成为治疗卒中理想的细胞来源。

MSCs能够直接穿过血脑屏障(blood brain barrier,BBB)到达脑损伤部位,通过减缓细胞凋亡过程[19],促进血管生成[20],抑制炎性并进行免疫调节[21],从而达到治疗IS的目的。移植MSCs可以降低卒中后神经元钙调磷酸酶的表达,达到减缓细胞凋亡并发挥神经保护的作用[22]。研究发现,MSCs能够避免免疫识别,分泌一系列的抗炎介质,改善和调节破坏性炎性反应,保持其免疫调节和抗氧化活性[23]。此外,移植MSCs可以刺激内源性神经发生,改善神经功能[24],这在IS发生后功能的恢复方面是十分重要的。

3.2 MSCs通过GJ治疗IS MSCs是干细胞治疗的主要类型之一,许多与之相关的临床前及临床试验得到了认可。研究表明,GJ偶联在细胞存活和维持干细胞自我更新状态方面有关键作用,而未分化的MSCs具有良好的GJ偶联[25]。Kikuchi-Taura等[26]通过观察卒中小鼠GJ通道阻断前后MSCs的作用,证明了移植的MSCs通过GJ介导可以与受体细胞(包括内皮细胞和循环中的淋巴细胞/单核细胞)之间进行直接细胞-细胞相互作用,结果显示GJ介导的MSCs抑制了血管内皮细胞摄取VEGF以及巨噬细胞/小胶质细胞的激活,这对IS后脑内炎症抑制是非常重要的。此外,他们还认为MSCs等同于脑血管周细胞(Pericyte,PC),起着血管内皮细胞的调节作用,在缺血/缺氧的条件下,PC可以获得多潜能干细胞活性,并可以分化为BBB/神经血管单位的主要成分,从而促进神经修复与血管生成[27]。根据Ogawa等[28]的推测,外源性MSCs可能通过从血管内吸收多余的能量来帮助血管内皮细胞恢复正常的代谢功能,这意味着应用MSCs治疗IS的最佳时间是在炎性反应活跃的急性期。

在大脑中,线粒体可从星形胶质细胞转移到神经元,有助于IS后的神经保护恢复[29]。Lu等[30]发现在损伤脊髓移植线粒体和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)能够改善脊髓损伤大鼠的运动功能恢复。BM-MSCs可以通过GJ将健康的线粒体转移到受损细胞,且间隙连接细胞间通信增强剂视黄酸增加了线粒体从BM-MSCs向神经元的转移量,减少了细胞凋亡并促进了细胞存活,产生ATP,减轻炎性反应,最终挽救受损神经元[30]。

4 HSCs

4.1 细胞来源与作用机制 HSCs可以直接从人类脐带血中获取[31],除了脐带血,HSCs已经在许多成人组织中被发现,但主要在骨髓、脾和肝脏中进行研究[32]。其中骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BM-MNCs)是一种丰富的造血干细胞来源,已广泛应用于缺血性疾病的实验治疗,包括IS[33]。

HSCs负责人体内所有血细胞的生成,在过去HSCs多用于治疗血液和免疫系统的恶性和非恶性疾病[34]。目前,移植HSCs已经演变成许多非血液疾病的治疗手段,尤其是大脑疾病[35]。移植后的HSCs可以提供旁分泌效应,如促进细胞存活、刺激神经干细胞的增殖和迁移、诱导受损脑细胞的再生、减少炎症以及促进血管生成[16]。此外,HSCs可以向受损的血管内皮细胞提供多种代谢产物以及氨基酸作为能量来源,有助于激活血管内皮细胞的能量代谢[28]。研究表明,在中脑动脉栓塞卒中模型中,移植HSCs有缩小其大脑皮质缺血性梗死体积的作用[36]。

4.2 HSCs通过缝隙连接治疗IS HSCs和骨髓(BM)微环境之间的相互作用对维持稳态和造血再生至关重要,来自骨髓造血微环境的体液和旁分泌信号控制HSCs活性,骨髓基质细胞的细胞间信号以细胞结合或分泌因子的形式,或通过物理相互作用的方式,调节HSCs在骨髓HSCs壁龛内的定位、维持和分化[37]。有研究提出,HSCs与血管内皮细胞的相互作用是通过GJ直接细胞-细胞接触来调节的[38]。据报道,给药后的HSCs向受损的脑血管内皮细胞捐献大量小分子物质,激活大脑的能量代谢,改善其功能,因此在卒中亚急性期,当炎性反应减轻后,是HSCs给药的最佳时间[28]。

葡萄糖在HSCs和血管内皮细胞之间通过GJ构成干细胞治疗的重要机制,BM-MNCs是一种富含造血干细胞的细胞组分,移植的BM-MNCs可以通过GJ的细胞-细胞相互作用激活脑内皮细胞。Kikuchi-Taura等[39]采用脑缺血模型评估移植BM-MNCs通过GJ细胞-细胞直接相互作用对缺血组织内皮细胞的影响,结果发现小鼠的BM-MNCs具有较高的葡萄糖浓度,通过GJ可以将葡萄糖等小分子从BM-MNCs转移到内皮细胞,从而增加血管内皮细胞对VEGF的摄取,这种能量来源可以激发血管生成,抑制自噬,并支持缺血后受损内皮细胞的生存。相反,阻断GJ可抑制VEGF的摄取。

5 NSCs

5.1 细胞来源与作用机制 NSCs大量存在于胎儿大脑中,尤其是在非常早期的发育阶段。从胎儿大脑中获取的NSCs可以在实验室中分离并生长为单层细胞或漂浮的球体,产生神经营养因子,并分化为更明确的神经元谱系[40]。目前,利用细胞分离和细胞培养技术的进步,实现了对大量NSCs的获取,促进了对NSCs的基础研究[41]。

NSCs是一种多能祖细胞,负责产生神经系统中的所有神经元和大胶质细胞[42]。NSCs应用的基础是能够释放神经营养因子并分化为神经和神经胶质细胞,从而促进神经发生和替代大脑的病变或损伤区域。移植NSCs可以维持BBB、减轻神经炎症以及增加神经发生,是治疗缺血性卒中的有效方法[43]。近年来,移植NSCs已经被证明可以通过神经保护以及免疫调节的方式,而不是简单的细胞替代来促进脑损伤后的功能恢复[44]。培养的NSCs可以分泌多种营养因子,如BDNF、EGF和VEGF,从而促进血管生成[45]。此外,研究表明移植NSCs后,IS引起的炎性反应显著减少,同时还抑制了小胶质细胞的激活[46],并且在IS后的免疫调节中下调了促炎因子和免疫细胞的活性[47]。

5.2 NSCs通过缝隙连接治疗IS 基于NSCs的治疗主要有两种策略：移植外源性NSCs和促进内源性NSCs的自我修复。Jiao等[48]发现细胞间连接在调控NSCs/神经前体细胞(Neural precursor cells,NPCs)的存活、增殖和分化等方面起着重要的作用,可以通过上调GJ和神经营养因子的表达来促进NSCs/NPCs的存活、增殖和神经元分化。GJ可以维持NSCs的稳态,通过GJ偶联移植小鼠或人NSCs功能整合到宿主神经环路,并影响宿主细胞是一种必要的方式。有研究发现,通过对外源性NSCs建立GJ,使其直接与宿主相互作用,起到了保护宿主神经元免于死亡并减少反应性星形胶质细胞增生症等继发性损伤的作用[49]。另外,NSCs通过早期的功能GJ,允许跨细胞传递动态平衡调节分子,以及通过钙波直接影响宿主的协调活动,可能会使原本濒临灭绝的神经元群体受益[49]。

6 ESCs

6.1 细胞来源与作用机制 ESCs来源于胚泡阶段的内细胞团,20世纪90年代末研究人员首次报道了人类胚胎干细胞(hESCs)的分离技术,极大地推动了人类神经分化的研究[50]。

ESCs是一种多能祖细胞,具有无限自我更新与在适当的条件下向体内分化所有细胞类型的能力[51]。ESCs可以先分化为NPCs,随后再分化为神经元或神经胶质细胞[52]。神经元替代疗法通常利用ESCs或诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)在体外分化的神经元,或者通过表达转录因子、信号分子或小分子治疗对分化的成体细胞进行直接重新编程[53]。另外,ESCs来源的细胞外小泡在IS发生后可以通过免疫调节的作用,减轻缺血性脑损伤,促进神经恢复[54]。

6.2 ESCs通过缝隙连接治疗IS 研究表明,功能性GJ是hESCs在不同培养条件下维持的共同特征,并且在hESCs增殖、凋亡、多能性与集落生长中发挥作用[55]。但由于ESCs的来源和使用在伦理和法律层面上存在争议,该领域的研究方向已逐渐向着iPSCs和成体干细胞等替代干细胞方向发展。

7 研究局限性

首先,在细胞移植过程中,干细胞的类型、来源、给药方式、给药时间以及剂量都可能影响治疗效果。大量的动物研究数据已经证明,在应用干细胞治疗后,受损的神经功能得到显著改善。因此,我们仍需要进一步的研究确定最佳的细胞类型、来源、途径、时机和剂量,为治疗常规建立详细和有效的标准,并加强对不良事件的监测和管理。

其次,干细胞的细胞归巢、细胞存活以及细胞追踪难的问题仍尚未解决。移植干细胞归巢是指从应用部位定向迁移到靶组织,其效率仍有待提高,归巢机制有待阐明[56]。脑卒中急性发病所带来的缺血、缺氧、营养因子缺乏、氧化应激与炎性反应,都会影响细胞的存活[57]。另外,理想的体内的细胞追踪技术有助于研究人员更好地提高细胞存活和迁移效率,并更好地评估干细胞治疗的有效性和安全性[58]。

最后,GJ允许相邻细胞之间调节离子或小分子的细胞间交换,并且是介导直接细胞质交换的惟一通道。然而,过去干细胞通过GJ介导治疗IS的研究多专注于葡萄糖这种可溶小分子。Ogawa等[28]提出,除葡萄糖外,还有许多分子极有可能通过缝隙连接进行转移,我们在未来可以继续探索缝隙连接传输分子的选择性或优先级,找寻更多优质的分子。

8 总结与展望

干细胞在治疗神经系统疾病方面显现出极大的可塑性,可以被诱导分化为各种类型的成熟神经细胞,此外,干细胞还可以分泌各种神经营养因子促进神经修复。上述研究已经证实了MSCs、HSCs、NSCs以及ESCs在IS基础研究和治疗应用中的重要价值,通过GJ可进一步提高干细胞移植的治疗效果。随着细胞分离和细胞培养技术的进步,特别是对ESCs和iPSCs的鉴定,极大促进了干细胞治疗IS的研究。一方面,GJ的细胞-细胞相互作用是缺血后损伤细胞自我更新和支持存活的重要途径,同时也是缺血后激活内皮细胞血管生成的主要途径。另一方面,干细胞的移植可以通过GJ释放多种神经营养因子来刺激神经再生、神经保护和神经功能的恢复。

目前,干细胞治疗仍处于实验室和动物模型阶段,但基于已报道的研究结果,干细胞治疗在各种动物模型中普遍被认为是安全的,并且具有良好的耐受性。但由于人体与动物模型存在差异,未来仍需进一步针对人体的干细胞疗法的安全性和有效性进行更多研究。一项成年卒中幸存者的横截面调查显示,仅有25%的受访者考虑接受干细胞疗法,并且他们对其安全性、有效性以及可负担性仍抱有顾虑[59]。随着对再生医学的重视,有助于在未来解决干细胞移植过程中尚未解决的技术问题,同时通过普及推广,从而增加患者及家属考虑接受这些治疗的可能性因素。干细胞通过GJ介导在治疗IS的领域有益的尝试已经取得了一定的成功,GJ的干预可能是干细胞治疗IS的有前景的策略,其疗效和临床应用前景值得进一步探索,最终帮助我们治疗IS。