猪伪狂犬病诊断方法与疫苗研究进展

何 松,汤德元,毛茵茗,周 飘,陈阊峥,罗 柳,陈 旭,廖正波,袁盛林

(贵州大学动物科学学院,贵州贵阳 550025)

猪伪狂犬病(Porcine pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的传染病,该病毒属疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、猪疱疹病毒属,PRV的核酸为双股线状DNA,可编码70～100种蛋白质,目前发现和命名的有11种糖蛋白,其中TK、gE为PRV主要的毒力基因[1]。猪作为PRV唯一的自然宿主,可引起母猪产死胎、木乃伊胎和屡配不孕;公猪睾丸萎缩、精液质量下降,丧失种用功能;新生仔猪出现高热、神经症状且2周龄以内的仔猪病死率可达100%。2011年之前,由于Bartha-K61疫苗在我国得到广泛使用,使PR在我国得到了较好的控制,但自从PRV出现变异后,其毒力增强,Bartha-K61疫苗对养猪业已经不能提供完全保护,PR在养猪业再度流行起来,给养殖者造成了巨大经济损失。据估计PR每年给全球养猪业造成的经济损失仅次于口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)和猪瘟(Classical swine fever,CSF)。因此,对PRV快速、准确检测已成为防控和净化PR的重要措施,本文对PR诊断方法和疫苗的研究做了综述,旨在为相关养殖场PRV的检测和防控提供参考。

1 诊断方法

1.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是运用抗体和抗原特异性结合的原理来对PRV进行检测,该方法具有操作简单、特异性好、敏感性高、样品检测所需时间短,可同时对多个样品进行检测等优点。黄雨晴等[2]以PRV gB重组蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗猪为二抗,建立了PRV IgA的间接ELISA检测方法,利用该方法对PRV黏膜免疫的仔猪进行检测,结果在仔猪鼻腔黏液中检测到特异的IgA抗体,为PRV黏膜免疫的初步检测提供了方法。通过重组PRV gB、gC、gD蛋白,建立以gB/C/D为包被抗原的间接夹心ELISA,用该方法对184份PRV阳性血清进行检测,结果重组蛋白ELISA与IDEXX试剂盒相比其阳性和阴性符合率分别为98.83%和100%,批内和批间变异系数均低于5%,表明重组蛋白ELISA的特异性高、灵敏度好,具有较好的应用前景[3]。以原核表达的PRV gD和gE蛋白作为检测抗原,建立gD和gE间接ELISA方法,两种方法对PRV阳性血清的最低检测敏感性分别可达到1∶25 600和1∶1 280,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)等6种病毒抗原的标准阳性血清无交叉反应,并且gE间接ELISA对PRV免疫血清检测为阴性,批内和批间重复性试验的变异系数分别低于5%和7%,联合应用两种方法对2 156份临床血清样品进行检测,结果PRV抗体阳性率为88.96%,PRV野毒抗体阳性率为4.04%,PRV免疫抗体阳性率为84.93%,表明gD和gE间接ELISA能够鉴别疫苗免疫抗体和野毒抗体,具有良好的敏感性、特异性和重复性,这为猪场PR的防控和净化提供了方法支撑[4]。

1.2 聚合酶链反应

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是目前快速扩增特定基因片段最常用的方法。该方法是将扩增后获得的目的片段进行电泳,根据不同核酸的相对分子质量在电泳中的迁移率不同,从而将目的核酸与其他病原核酸分离。PCR与其他传统方法相比具有耗时较少、特异性和灵敏度高等特点。将可视化的横向流动试纸条(LFD)与PCR技术结合,实现了对PRV野毒株的特异、快速检测,对PRV Bartha-K61株、多种病毒和细菌均无交叉反应,重复性好,对50份样品进行检测发现,与PCR相比其敏感性更高,该方法不需要电泳步骤即可读取结果,有利于基层技术人员现场检测[5]。将纳米材料加入到PCR反应体系中,优化后建立PRV纳米PCR,与常规PCR相比,其退火温度更加宽泛,不受靶基因GC含量和引物Tm值影响,对高GC含量靶基因的反应液更容易扩增,该技术为优化PCR检测PRV提供了新思路[6]。近年来,由于多重PCR能够对相似的病例进行鉴别诊断而受到重视。根据Ⅱ型PRV gC基因上与Ⅰ型PRV不同的多位点稳定差异基序,建立双重PRV基因分型PCR,该方法能够准确鉴定PRV 基因型,针对Ⅰ、Ⅱ型 PRV 的最低检测限均为1×104拷贝,对猪流行性腹泻病毒(Porcien epidemic diarrhea virus,PEDV)等6种病毒无交叉反应,对44份猪临床病料进行检测,结果与常规PCR相比符合率达到100%,该方法对PRV流行病学调查提供了有效技术手段[7]。建立PRV等多重PCR[8],可对PRRSV等3种繁殖障碍性疫病进行检测,对PRV最低检测限度为14.60 pg,对临床上收集的168份病料进行检测,结果为阳性的样品再用商品化的试剂盒进行检测,符合率达100%。在此基础上对猪日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)进行检测,建立四重PCR,对51份广西地区出现猪繁殖障碍临床症状的样品进行检测,与特异性检测方法相比结果一致,该方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,但该研究中临床样本量较少,仍需要应用该方法对疑似阳性更大数量的临床样品进行检测,以进一步评估其临床效果[9]。针对PRV等疫病建立7重PCR,对贵州地区的150份病料进行检测,发现病猪中出现混合感染的高达80%,病猪临床表现多样化,表明养猪场混合感染较为普遍,PRV多重PCR的建立可为养猪场防控和逐步净化各种疫病提供技术指导[10]。

1.3 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR)是由核酸探针技术、荧光共振传递技术和PCR三者结合而成,可对样品起始模板量进行绝对定量,其特异性、灵敏度比普通PCR更高,因而在对病原核酸检测中得到广泛应用。通过单叠氮丙锭(PMA)核酸染料在分解时能产生与PRV核酸共价交联的氮烯化合物的特性,用该核酸染料与qPCR结合建立了PMA-qPCR技术,当PMA浓度范围为50 ～100 μL时,热灭活就能区分感染猪的PRV是否具有传染性,检出率可达96%,该方法稳定、特异性高,可为PRV消毒效果评价等提供技术指导[11]。为了能够更快速、特异对病猪的多种疾病进行鉴别诊断,建立了三重qPCR[12],该方法能够对PRV经典株、变异株和Bartha-K61疫苗株不同株系进行鉴别,对Bartha-K61、TJ 株、SC株的检测限分别为5、50和50拷贝,通过该方法对234个样品进行检测,结果与病毒分离方法相比经典株、变异株和Bartha-K61疫苗株的符合率分别为100%、99.2%和100%,表明该方法灵敏度和特异性极好,可用于不同PRV毒株的区别检测,同时还建立了一种交叉引物扩增试纸条联用法(CPA-strip),用于检测PRV野毒,该检测方法对PRV变异株的最低检测限为200个拷贝,对293个临床样品进行检测,结果与三重qPCR的符合率为100%,与病毒分离方法的符合率为97.3%,该方法操作简单,可用于临床现场检测。有研究建立了可同时检测和区分8种常见猪病毒和细菌病原体的多重TaqMan qPCR,能够对猪圆环病毒2型(Porcine circovious 2,PCV2)等4种常见病毒性疫病和猪链球菌(S.suis)等4种常见细菌性疾病病原体进行检测,该方法具有较好的线性关系,相关系数R2均大于0.997,变异系数低于5%,其灵敏度与普通PCR相比高出10倍多,比四重qPCR检测范围更广,该方法为猪体内多种病原体的流行病学调查、诊断和鉴别提供了技术支持[13]。与常规PCR方法相比,qPCR方法具有更高的灵敏度且可进行准确定量,但是qPCR方法的应用需要昂贵的实验仪器以及专业的操作人员,因此无法大范围推广应用。

1.4 环介导等温扩增

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是在等温条件下对核酸进行扩增的新技术。基于PRV gB蛋白的保守性设计引物,建立PRV的LAMP检测技术,并把羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)应用于LAMP反应体系中作为结果判定的指示剂,对PRV检测限为10拷贝,与PCR特异性一致,敏感性比PCR高出103倍,当HNB浓度为150 μmol/L时,阴、阳对照组的颜色有明显差异,含有HNB的LAMP体系可定性的用于扩增产物的判断[14]。根据PRV DBP基因序列设计6对引物,建立PRV-LAMP检测方法[15],在40 min内就可以得到最佳结果,对JEV等4种病毒无交叉反应,特异性好,与丹明B衍生物荧光染料相结合后,阳性样品颜色呈现为蓝色,阴性样品为紫色,可直接读取结果,该方法缩短了PRV检测时间,提高了检测效率。用LAMP与pH指示剂结合构建了对PRV野毒株快速检测方法[16],与qPCR敏感性一致,检测极限为100.5TCID50,对52份临床样品检测,结果与qPCR检测相比,两者符合率为94.2%,该方法结果易判断,检测成本低,可预期应用于PRV隐性感染猪的快速筛查。在应用离心微流体盘(centrifugal microfluidic disk,CMFD)的基础上,建立可同时检测6种疫病病原进行的LAMP[17],通过与微流控芯片技术结合,可以在60 min内得到结果,对多种病毒无交叉反应,检测极限为320拷贝,该方法能更灵敏地检测病毒混合感染。

1.5 其他方法

基于Fe3O4和SiO2-NH2磁性聚合物微球和多壁碳纳米管(magnetic polymer microspheres and multi walled carbon nanotubes,MWCNTs)的新型纸质生物传感器,可对PRV进行快速检测,检测限为10 ng/ mL[18]。快速检测PRV野生型分离株和gE基因缺失病毒疫苗的双重液滴数字PCR(duplex droplet digital PCR,ddPCR)技术[19],与TaqMan qPCR相比,ddPCR的检测限为4.75拷贝,比qPCR敏感性高16倍,且在极低浓度下ddPCR仍然能保持线性关系,该方法可为PRV的早期检测提供技术支持。基于聚二甲基硅氧烷的固相蛋白芯片平台,可对PRV gD和gE抗体进行双重检测,用纯化的gD和gE蛋白通过自动点样器包被到高度疏水的纳米膜上,测定其灰度值来对结果进行判断,该方法与中和试验相比,在免疫猪血清样品的gD抗体测试中显示出相同的灵敏度,但拥有比商业gE抗体检测试剂盒更高的灵敏性,具有较好的应用前景[20]。

2 疫苗研究

2.1 灭活疫苗

PRV灭活疫苗是将分离得到的PRV野毒株经灭活剂灭活后,加入一定量的佐剂乳化而成。陈焕春在2001年基于PRV鄂A株病料成功研制了我国第1个PR全病毒油乳灭活疫苗,该疫苗具有较高的免疫保护效力,但自从PRV出现变异毒力增强后,该疫苗无法对养猪场提供完全保护。有研究分离出高毒性PRV株 FJ-2012,制备了FJ-2012ΔgE/gI-GEL02和FJ-2012ΔgE/gI-206VG 两种缺失gE/gI基因的PRV灭活疫苗,通过免疫仔猪来评估两种疫苗的免疫效果,发现两种疫苗对PRV FJ-2012攻击均有效,仔猪均存活,并产生了高水平的gB特异性抗体和中和抗体,表明该疫苗能够在一定程度上保护仔猪[21]。环二聚鸟苷一磷酸(cyclic dimeric guanosine monophosphate,c-di-GMP)对小鼠具有免疫调节活性,将c-di-GMP 作为PRV灭活疫苗的免疫增强剂,发现PRV灭活疫苗诱导的免疫反应得到提高,免疫效果达到了与减毒活疫苗相当的水平,这为改善PRV灭活疫苗免疫效力研究开辟了新的道路[22]。PRV自然感染猪的途径是鼻腔和口腔,因此PRV的鼻内免疫接种显得尤为重要,但目前我国猪鼻内PRV疫苗免疫效果不甚理想。为了弥补这方面的不足,开发了一种由MONTANIDETMGel 01和CVCVA5组成的联合佐剂[23],应用于PRV鼻内灭活疫苗接种小鼠后,用PRV强毒攻击小鼠发现与其他单一佐剂疫苗相比,联合佐剂诱导了更大的黏膜IgA免疫和血清抗体反应,明显提高了PRV鼻内灭活疫苗的免疫效力,可诱导长期T淋巴细胞记忆,提供长期保护。传统灭活疫苗具有安全性高,在猪体内不会发生隐性感染等特点,但与弱毒疫苗相比,传统灭活疫苗具有抗原含量不足、接种量大、需多次接种且免疫效果不佳等多种缺陷。

2.2 弱毒疫苗

弱毒疫苗通常是将PRV毒株在非易感细胞或鸡胚上经多次传代使其毒力减弱而制备的疫苗,与传统的灭活疫苗相比,弱毒疫苗具有良好的免疫原性,更能激发机体全面的免疫应答。有研究以PRV变异株HeB12为基础,制备缺失gE、gI和TK基因的gE/gI/TK PRV冻干活疫苗[24],该新型三基因缺失变异活疫苗对经典RA株和变异体TJ12株具有完全的交叉保护作用,在一定程度上弥补了Bartha疫苗的不足。用CRISPR/Cas9技术敲除了PRV gI、gE、US9和US2基因,研制了P-RV GDFS-delgI/gE/US9/US2减毒活疫苗,该疫苗对仔猪不产生gE特异性抗体,但可以产生gB特异性抗体和针对PRV GDFS株或PRV Ea株的高中和效价,免疫效果好,可以对仔猪中新出现的部分PRV变异毒株提供全面保护[25]。增加PRV TK基因的敲除,开发一种PRV GX-ΔTK/IES弱毒疫苗,用PRV GX-ΔTK/IES疫苗和商业疫苗分别对小鼠接种,发现 GX-ΔTK/IES疫苗诱导的免疫力和保护水平均优于商业活疫苗,对非目标和目标动物均安全,该疫苗有望成为新型的PRV基因缺失活疫苗的候选疫苗[26]。

2.3 基因缺失疫苗

PR基因缺失疫苗保留了PRV的免疫原性,敲除了PRV单个或多个毒力基因而构建的,具有对敏感动物致病极弱,不易出现返毒现象等特点。以PRV变异毒株HNXY为基础,构建gE和TK双基因缺失的毒株rPRV-HNXY-ΔgE/ΔTK[27],该毒株对小鼠无致病力,对新生仔猪安全且能产生免疫抗体,散毒可能性极低。构建gE/TK/US3多基因缺失的PRV ΔgE/TK/US3株[28],接种PRV ΔgE/TK/US3的小鼠可诱导更高水平的 PRV 特异性中和抗体和IFN-γ等细胞因子,比PRV ΔgE/TK免疫原性更高,为养殖户提供了更多疫苗选择。用PRV HN1201毒株构建多重基因缺失的rHN1201 TKΔ / gEΔ / gI Δ/ 11kΔ / 28kΔ株[29],将其免疫猪后其体温明显低于用经典伪狂犬病疫苗免疫的猪,产生的特异性中和抗体对PRV经典毒株和变异毒株均有效,可引发更早、更高水平的gB抗体,能够对免疫猪起到快速保护作用。PRV基因缺失疫苗是目前应用最为广泛的疫苗,此类疫苗免疫动物后,可以结合血清学方法鉴别野毒感染和疫苗免疫,在PRV的根除计划中发挥了重要作用。

2.4 重组伪狂犬病毒载体疫苗

PRV基因组约为150 kb,含有73个基因,编码的蛋白中有一半为PRV复制的非必需蛋白,这为PRV作为外源基因的理想载体提供了条件。用CRISPR/Cas gE基因编辑技术和同源重组技术构建猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)刺突 (S) 蛋白的重组伪狂犬病病毒(rPRVXJ-delgE/gI/TK-S)[30],重组株rPRVXJ-delgE/gI/TK-S免疫小鼠后,其外周血中IFN-γ、IL-4表达上调和脾脏淋巴细胞增多,加强免疫后,在小鼠体内检测到PRV gB和PDCoV S特异性抗体,该疫苗具有良好的免疫源性,对强毒株PRV XJ的感染可以提供100%保护,有望成为抗PRV和PDCoV的候选疫苗。以PRV变异株XJ和NADC30样PRRSV株CHSCDJY-2019为亲本,构建了gE/gI/TK基因缺失共表达PRRSV GP5和M 蛋白的重组伪狂犬病病毒(rPRV)-NC56[31],用 rPRV-NC56 接种小鼠可诱导 PRV和NADC30样 PRRSV特异性体液和细胞免疫反应,为同时预防PRV和PRRSV感染带来了曙光。以缺失了gG、gE和TK三重基因的PRV为疫苗载体,构建含有PCV2b衣壳、CSFV-E2和Erns-牛粒细胞融合单核细胞集落刺激因子(Erns-GM-CSF)的三价疫苗(PRVtmv+)[32],该疫苗对猪安全且高度减毒, 用PCV2b感染猪后,PRVtmv+对免疫猪产生了比商业疫苗更好的保护作用,并对PRV和CSFV 产生了特异性中和抗体,可预期应用于防控PRV、PRRSV和PCV的感染。由于重组伪狂犬病毒载体疫苗能够起到一针多防的目的,因此研制基因工程活载体多价疫苗用于预防疫病成为了当前热点。

3 展望

PR尚无特效防治药物,PRV易与其他疾病发生混合感染,我国拥有世界上最大生猪养殖量,不同地方对养殖场的管理制度有差异,这为防控PR增加了难度。近年来,发现有些天然产物如(S)-10-羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin,10-HCPT)等对伪狂犬病毒复制具有抑制作用,能够作为控制PRV感染的治疗剂,也有用反密码子工程转移RNA(anticodon-engineered transfer RNAs,ACE-tRNA)等技术来控制含有过早终止密码子(PTC)的PRV复制,使PRV在小鼠体内完全失去毒力,进而引起强烈的免疫反应。虽然这些新药和技术能够在不同方面对PRV起作用,但尚处于研发的起始阶段,无法在短时间内投入应用。因此,对PRV的快速、高效、准确检测,对猪群接种疫苗仍是防控和净化PRV重要的手段。美国、日本等发达国家已经成功根除和净化了PRV,这为我国防控和净化PRV提供了经验。相信随着对PRV结构和功能研究的不断深入以及技术的不断发展,会研发新的检测方法和安全有效的新型疫苗,使PRV在我国得到彻底净化或根除。