miR-525-5p、围脂滴蛋白3 的表达与胶质瘤预后的关系研究

鲁永织 万诗扬 韩真真 张 亮 孙 炜

1.青岛市市立医院肿瘤科，山东青岛 266000；2.青岛市胶州中心医院放疗科，山东青岛 266000；3.青岛市第八人民医院重症医学科，山东青岛 266000；4.青岛市第三人民医院神经内科，山东青岛 266000

胶质瘤是中枢神经系统常见的恶性肿瘤之一，我国发生病例和死亡病例均居全球第三位[1]。胶质瘤恶性程度高、侵袭能力强，长期预后较差，寻找胶质瘤预后影响因素对改善患者预后非常重要[2]。研究表明，微核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）和脂质代谢异常参与胶质瘤发生、发展[3-4]。有研究报道，miR-525-5p 在乳腺癌、宫颈癌等恶性肿瘤中异常表达，并与患者预后有关[5-6]。围脂滴蛋白（perilipin，PLIN）3 是一种脂滴相关蛋白，能通过结合脂滴表面特异性位点参与脂质代谢调节[7]。有研究报道，PLIN3 在肺腺癌、肾透明细胞癌等恶性肿瘤中异常表达，并与患者预后有关[8-9]。但目前关于胶质瘤组织中miR-525-5p、PLIN3表达与胶质瘤患者预后的关系尚未可知。基于此，本研究报道如下，以期为改善胶质瘤患者预后提供更多依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年2 月至2020 年7 月青岛市市立医院收治的102 例胶质瘤患者，收集术中部分瘤组织和瘤旁组织。纳入标准：①患者或家属提供书面知情同意；②年龄≥18 岁；③通过病理检查确诊；④研究资料完整；⑤患者为初次诊断。排除标准：①没有手术指征；②合并其他恶性肿瘤；③合并其他颅内疾病；④合并急慢性感染；⑤入院前已接受过抗肿瘤治疗。本研究经青岛市市立医院伦理委员会批准（2023 临审字第169 号）。

1.2 试验方法

1.2.1 实时荧光定量聚合酶链式反应 部分组织于液氮下碾磨成末，Trizol 法提取组织总RNA，分光光度仪鉴定其合格（吸光度260/280 比值为1.8～2.0）后，将RNA 反转录为cDNA。按照南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供的SYBRPremix Ex TaqTM试剂盒说明书进行实时荧光定量聚合酶链式反应。反应体积：cDNA 5 μl、2×SYBR Green PCR Mix 12.5 μl、正反向引物各1.5 μl、ddH2O 加至总体积25 μl；反应条件：95℃10 min 1 次，95℃10 s、64℃10 s、72℃30 s，40次。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司设计合成，miR-525-5p 正向引物5’-TCGGCAGGCTCCAGAGGGATGCA-3’，反向引物5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；miR-525-5p 内参U6 正向引物5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。PLIN3 正向引物5’-GCAACTGGCCGCTCTACTG-3’，反向引物5’-AGAAGACCTCCAACTTGACCA-3’；内参GAPDH 正向引物5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3’，反向引物5’-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3’。反应完成后通过2-ΔΔct法计算组织中miR-525-5p、PLIN3 mRNA 相对表达量。

1.2.2 免疫组织化学染色法 部分组织收集后立即用超纯水冲洗，然后福尔马林固定，常规脱水、透明、包埋、切片、脱蜡后，磷酸盐缓冲液洗涤切片以修复抗原，将内源性过氧化物酶滴于载玻片，室温避光孵育15 min。加入一抗PLIN3（1∶100）[三岸生物科技（上海）有限公司，编号：D194875]和磷酸盐缓冲液（对照），次日加入二抗，37 ℃孵育1 h。DAB 染色剂显色，蒸馏水冲洗停止显色，再滴加苏木精-伊红染色剂染色组织细胞核，蒸馏水冲洗停止染色。最后梯度酒精脱水后中性树脂封片，显微镜下观察染色。无阳性细胞、阳性细胞占比＜25%、25%～50%、＞50%～75%、＞75%分别为0、1、2、3、4 分；染色强度：无着色、弱阳性、中等阳性、最强阳性分别为0、1、2、3 分；二者乘积≥2 分表示阳性[10]。

1.3 随访与分组

胶质瘤患者出院后进行为期3 年的随访，包括电话或门诊随访。在第1 年，随访频率为每3 个月1 次，之后从第2 年开始，改为每6 个月1 次，一直进行到2023 年3 月或患者发生终点事件（如死亡）。统计3年总生存率，根据生存情况分为存活组和死亡组。根据胶质瘤组织中PLIN3 mRNA 的表达均值，将患者分为高表达组和低表达组。

1.4 统计学方法

使用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，比较采用t 检验；计数资料采用例数和百分率表示，比较采用χ2检验；采用Pearson 进行相关性分析。生存曲线将通过Kaplan-Meier 法绘制，生存率差异通过log-rank χ2检验评估。影响因素通过多因素Cox 回归模型进行分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胶质瘤组织与瘤旁组织中miR-525-5p、PLIN3 mRNA 表达比较

胶质瘤组织中miR-525-5p 表达（0.66±0.14）低于瘤旁组织（1.11±0.18），PLIN3 mRNA 表达（1.86±0.29）高于瘤旁组织（1.24±0.16）（t=21.785、17.947，均P＜0.001）。

2.2 胶质瘤组织与瘤旁组织中PLIN3 蛋白表达

免疫组织化学染色结果显示，PLIN3 蛋白阳性染色主要位于细胞质，胶质瘤组织PLIN3 蛋白阳性表达率为61.76%（63/102），高于瘤旁组织的10.78%（11/102）（χ2=57.341，P＜0.001）。见图1。

图1 胶质瘤组织与瘤旁组织PLIN3 免疫组织化学染色（100×）

图2 miR-525-5p 与PLIN3 的结合位点图

图3 胶质瘤组织中miR-525-5p 与PLIN3mRNA 表达的相关性

图4 不同PLIN3 mRNA 表达胶质瘤患者Kaplan-Meier 生存曲线

2.3 胶质瘤组织中miR-525-5p 与PLIN3 mRNA 表达的相关性

经TargetScan 数据库预测，miR-525-5p 与PLIN3的3’非翻译端49～55 处存在结合位点，见图2；Pearson 相关性分析结果见图3，miR-525-5p 与PLIN3 mRNA 在胶质瘤组织中表达呈负相关（r＝-0.664，P＜0.001）。

2.4 胶质瘤组织中PLIN3 mRNA 表达与总生存率的关系

随访3 年，中位随访时间22 个月，102 例胶质瘤患者失访4 例，死亡50 例，3 年总生存率为50.98%（52/102）。Kaplan-Meier 生存曲线分析显示，PLIN3 mRNA 高表达组（53 例，≥1.86）3 年总生存率为41.51%（22/53），低于低表达组（49 例，＜1.86）的61.22%（30/49）（log-rank χ2=7.247，P=0.007）。见图4。

2.5 胶质瘤患者预后的单因素和多因素Cox 回归分析

以胶质瘤患者预后为因变量（赋值：死亡/ 存活=1/0，剔除失访4 例），随访时间为时间变量，性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤数目、肿瘤直径、分化程度、WHO 中枢神经系统肿瘤分级、PLIN3 mRNA 为自变量，将单因素Cox 回归分析中差异有统计学意义的变量纳入多因素Cox 回归模型。结果显示：低分化、WHO 中枢神经系统肿瘤分级Ⅲ～Ⅳ级、PLIN3 mRNA≥1.86 为胶质瘤患者死亡的独立危险因素（HR＞1，P＜0.05）。见表1～2。

表1 胶质瘤患者预后的结果的一般情况比较[例（%）]

表2 胶质瘤患者预后的单因素和多因素Cox 回归分析

3 讨论

胶质瘤是起源于脑神经胶质细胞的恶性肿瘤，具有高致残率和高复发率特点[11]。研究胶质瘤相关病理分子机制和评估患者预后，对指导治疗措施制订和促进患者预后改善意义重大。

miRNA 是来源于独特发夹结构的一类单链RNA，能通过与靶基因互补配对降解或抑制mRNA翻译，进而参与胶质瘤发生、发展[12]。miR-525-5p 定位于人染色体19q13.42，多项研究报道了其在不同恶性肿瘤中的作用，如上调miR-525-5p 能靶向Rho GTP 酶活化蛋白11A 抑制非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭和诱导细胞凋亡[13]；上调miR-525-5p 能靶向含E1 冷休克结构域抑制乳腺癌细胞增殖和诱导细胞凋亡[14]。同时有学者指出，miR-525-5p 低表达与肺腺癌、胸腺癌患者预后不良有关[15]。Xie 等[16]研究报道，miR-525-5p 在胶质瘤组织和细胞中表达下调。代谢重编程是包括胶质瘤等恶性肿瘤的突出特征之一，可通过改变脂质代谢、氨基酸代谢、乳酸代谢等代谢过程为肿瘤细胞提供其生长和生存所需的能量，进而促进肿瘤细胞恶性进展[17]。PLIN3 是特异性表达于脂滴表面的一种高磷酸化蛋白，能通过与其他分子相互作用介导脂质合成和分解，在脂质代谢调控中发挥至关重要的作用[18]。既往研究多报道PLIN3 与脂类疾病的关系，近年研究发现PLIN3 也参与恶性肿瘤过程，如抑制PLIN3 表达能抑制肝细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭[19]；抑制PLIN3 表达能控制肺癌细胞中的脂滴形成和甘油三酯储存，进而抑制肺癌恶性进展[20]。有研究指出，人类胶质母细胞瘤标本中可检测到PLIN3 高表达[21]。因此推测miR-525-5p、PLIN3 可能影响胶质瘤患者预后，故本研究进一步探讨了miR-525-5p、PLIN3 表达与胶质瘤患者预后的关系。

本研究结果显示，胶质瘤组织中miR-525-5p 低表达，PLIN3mRNA 和PLIN3 高表达，提示miR-525-5p、PLIN3 可能参与胶质瘤发生过程。其机制可能是miR-525-5p 低表达可上调信号转导和转录激活因子1，激活叉头盒蛋白M1、核因子κB 信号通路诱导胶质瘤细胞上皮-间质转化，促进胶质瘤恶性进展[16]。而PLIN3 高表达能改变脂质代谢，促进肿瘤细胞脂质储存和利用，为胶质瘤细胞侵袭、浸润提供更有利的条件，进而促进胶质瘤恶性进展[18]。本研究通过在线数据库分析预测发现miR-525-5p 与PLIN3 存在结合位点，随后的相关性分析显示在胶质瘤组织中，miR-525-5p 与PLIN3 mRNA 表达呈负相关，提示它们可能在胶质瘤的发展中共同参与。最近的研究也支持这一发现，升高miR-525-5p 水平可以通过靶向下调PLIN3 的表达来抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭和增殖[22]。这加强了本研究结果的可靠性。通过随访分析，本研究发现PLIN3 mRNA 高表达与胶质瘤患者3 年总生存率下降相关，是患者死亡的独立危险因素。这显示在胶质瘤组织中，PLIN3 mRNA 的表达与患者的预后密切相关，可能成为新的生物标志物用于评估胶质瘤的预后。

综上所述，胶质瘤组织中miR-525-5p 低表达和PLIN3 mRNA 高表达，二者表达呈负相关，PLIN3 mRNA 高表达与胶质瘤患者预后不良有关，可能成为胶质瘤预后评估新的生物标志物。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。