酿酒酵母培养条件优化

潘冬梅，杨传伦，张心青，李 杰，李大鹏，韩立霞，冯文娟，和富明，傅英旬，翟 娇，成鲁南，李丙祥

（1.黄河三角洲京博化工研究院有限公司，山东滨州 256500；2.山东博华高效生态农业科技有限公司，山东滨州 256500；3.山东京博控股集团有限公司，山东滨州 256500）

益生菌微生态制剂是全面禁抗环境下产生的一种新型绿色添加剂，能有效维持胃肠道微生态平衡，改善微生物种类（刘潇，2018），提高消化吸收，并具有无残留、无毒副作用的优点（Lokapirnasari 等，2019）。酿酒酵母是常用的益生菌微生态制剂，可降低家畜瘤胃中的氧气（Gao等，2017），利于有益菌的繁殖，提高饲料消化率，改善家畜健康状态和生产性能（He 等，2019）。目前涉及酿酒酵母作为益生菌微生态制剂的研究较多。

Thrune 等（2020）研究发现，酿酒酵母的重要作用之一是减缓瘤胃家畜pH 的下降，从而保持瘤胃健康，提高家畜生产性能。牛建康等（2021）研究结果显示，添加酿酒酵母的奶牛瘤胃pH 为6.22 ～6.27，处于正常范围且波动较小。Chaucheyras-Durand 和Fonty（2022）、Marden等（2021）多项研究表明，酿酒酵母可以降低瘤胃家畜的氧化还原电势，有利于提高并促进厌氧微生物的活性。Ding 等（2019）研究表明，酿酒酵母可提高瘤胃微生物丰度。金鑫（2019）研究发现，酵母细胞壁（Yeast cell wall，YCW）由β- 葡聚糖和甘露聚糖两种主要功能成分组成，可以作为免疫调节因子提高家畜免疫力。Bose 等（2022）、Brown 等（2021）研究表明，β- 葡聚糖可与巨噬细胞和淋巴细胞等表面受体结合，从而刺激机体 免 疫 系 统。Machová 和Bystricky（2022）、Cheng 等（2020）研究发现，甘露聚糖具有良好的免疫原性、抗氧化性及抗炎等功能。

近年来，人们利用微生物发酵技术为基础获得酿酒酵母益生菌微生态制剂（赵小丽等，2014），已取得一定进展。微生物的培养条件（如培养温度、培养时间、培养基初始pH、菌龄、接种量等）在很大程度上影响酿酒酵母的发酵水平（李聪，2014），关乎酿酒酵母作为益生菌微生态制剂的应用成本。王颖等（2007）报道，通过优化酿酒酵母S.cerevisiae高密度培养条件优化，温度30℃、转速150 r/min，菌液最高OD600值和细胞密度分别达15.82 和2.03×108CFU/mL。宋志元等（2015）报道表面，通过优化酿酒酵母发酵条件，初始pH值6.0，装液量75 mL/500 mL，接种量5.0%，振荡速率180 r/min，发酵温度30℃，酿酒酵母活菌数达到5.8×108CFU/mL。

为进一步改善酿酒酵母的培养条件，提高菌体产量，降低应用成本。本试验在前期酿酒酵母培养基优化基础上采用单因素试验筛选酿酒酵母培养条件，再以酿酒酵母菌体干质量（dry cell mass，DCM）为响应值，利用响应面法对酿酒酵母培养基条件进行优化，为酿酒酵母生产提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验菌种 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由本实验室筛选保藏。

1.1.2 试剂 葡萄糖、硫酸铵、磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸锌、硫酸锰、维生素B1、维生素B7（分析纯或生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司；糖蜜（工业生产用）、酵母抽提物（分析纯或生化试剂）：安琪酵母股份有限公司。

1.1.3 培养基 种子培养基（g/L）（陈雪等，2014）：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10，121℃灭菌20 min。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖48、糖蜜50、酵母抽提物78、硫酸铵2、磷酸氢二钾3、氯化钙0.1、硫酸锌0.05、硫酸锰0.05、维生素B10.1、维生素B70.1，121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备 XY-1B/2C 电子天平：江苏省常州市Xingyun ；405-60-SC 型精密pH 计：梅特勒；BKQ-Z301 立式压力蒸汽灭菌器：山东博科集团；SW-CJ-2G 型超净工作台：聚创环保设备有限公司；HZQ-QD 型恒温恒湿振荡培养箱：苏州威尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试验方法

（1）种子液制备：挑取1 环酿酒酵母菌株的新鲜斜面接种于100 mL YPD 培养基 中，28 ℃，180 r/min 条 件 下 震 荡 培 养16 h（OD600nm=1.2 ～1.4）。

（2）发酵方法：将菌龄为16 h 种子液，按5%接种于装有100 mL 初始pH 为7.0 发酵培养基中，28℃，180 r/min 条件下震荡培养48 h，检测酵母菌体干质量。

（3）酵母菌体干质量（dry cell mass，DCM）的测定（Xu 等，2016）：酵母发酵液6000 r/min离心5 min，用蒸馏水洗涤菌体2 次，105℃烘干至质量恒定。

1.3.2 酿酒酵母培养条件优化

（1）单因素试验 培养温度筛选：将菌龄为16 h 种子液，按5% 的接种量、接种于初始pH 为7.0 灭菌后的发酵培养基中，发酵温度分别为22、24、26、28、30℃，180 r/min 条件下振荡培养48 h后检测酵母菌体干质量。

培养时间筛选：将菌龄为16 h 种子液，按5%的接种量接种于初始pH 为7.0 灭菌后的发酵培养基中，按已确定培养温度，180 r/min 条件下振荡培养时间分别为24、48、72、96、120 h 后检测酵母菌体干质量。

培养基初始pH 筛选：将菌龄为16 h 种子液，按5% 的接种量接种于初始pH 分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 灭菌后的发酵培养基中，按已确定发酵温度，180 r/min 条件下振荡培养已确定时间后，检测酵母菌体干质量。

菌 龄 筛 选：将 菌 龄 分 别 为8、12、16、20、24 h 种子液，按5% 的接种量接种于已确定初始pH 灭菌后的发酵培养基中，按已确定发酵温度，180 r/min 条件下振荡培养已确定时间后检测酵母菌体干质量。

（2）响应面试验 根据酿酒酵母培养条件单因素优化结果，选择对酵母菌体干质量影响较大的培养温度、培养时间、培养基初始pH、菌龄4 个因素，采用Box-Behnken 试验设计作响应面试验（WANG 等，2015），试验设计因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken 试验设计因素与水平

2 结果与分析

2.1 酿酒酵母培养条件单因素试验

2.1.1 培养温度试验 酿酒酵母培养温度不同，生长速率也不同，在合适的温度下酵母菌体干质量积累多。由图1 可知，在培养温度为24℃时，酵母菌体干质量最高，为24.10 g/L；当培养温度为24 ～30℃时，酵母菌体干质量随温度升高而下降，可能高温加速了酵母菌体的衰亡，导致酵母菌体干质量降低（邹艳等，2017）。因此，酿酒酵母最适培养温度为24℃。

图1 不同培养温度对酵母菌体干质量的影响

2.1.2 培养时间试验 由图2 可知，当培养时间为24 ～72 h 时，酵母菌体干质量随培养时间延长而增高；培养时间为72 h 时，酵母菌体干质量最高，为27.34 g/L；当培养时间为72 ～120 h 时，酵母菌体干质量有所下降。因此，酿酒酵母最适培养时间为96 h。

图2 不同培养时间对酵母菌体干质量的影响

2.1.3 培养基初始pH 试验 由图3 可知，培养基初始pH 为6.5 时酵母菌体干质量最高，为28.67 g/L，pH 偏低或偏高都不利于酵母菌体的生长。因此，酿酒酵母最适培养基初始pH 为6.5。

图3 不同培养基初始pH 对酵母菌体干质量的影响

2.1.4 菌龄试验 菌龄代表种子液的培养时间，种子液在对数期转接发酵瓶，菌种生理代谢最强，不同菌龄对酵母菌体干质量的影响结果见图4，当菌龄为12 h 时，酵母菌体干质量最高，为29.31 g/L，种子液处在对数期。因此，酿酒酵母最适菌龄为12 h。

通过酿酒酵母培养条件单因素试验优化，酿酒酵母在培养条件为：培养温度24℃、培养时间96 h、培养基初始pH6.5、菌龄12 h 时，酵母菌体干质量最高为29.56 g/L。

2.2 酿酒酵母培养条件响应面试验

2.2.1 Box-Benhnken 试验结果与分析 根据酿酒酵母培养条件单因素优化结果选择对酵母菌体干质量影响较大的培养温度（A）、培养时间（B）、培养基初始pH（C）、菌龄（D）为自变量，酵母菌体干质量（R）为响应值，运用Box-Benhnken 试验设计29 组试验。设计及结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 Box-Behnken 试验设计结果

表3 回归模型方差分析

所得的多元二次回归方程为：

由表3 可知，模型相关系数R2=0.9614，调整决定系数R2Adj=0.9227，模 型P值＜0.0001，模型显著；失拟项P值0.0562 ＞0.05，失拟项不显著，表明模型可用于分析酿酒酵母的培养条件试验结果（Marek 等，2016）。由P值可知，一次项A，交互项CD，二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。由F 值可知，4 个因素对酵母菌体干质量影响由大到小顺序为：培养温度（A）＞培养基初始pH（C）＞菌龄（D）＞培养时间（B）。

图5 为根据多元二次回归方程绘制培养基初始pH（C）和菌龄（D）交互作用的三维响应面图。由图6 可知，酵母菌体干质量随着培养基初始pH（C）和菌龄（D）两者均呈现先增加后减少的趋势，C、D 交互作用响应面较为陡峭，等高线椭圆程度较为明显，对酵母菌体干质量的影响极显著（P＜0.01）（Kieliszek 等，2015）。根据二次回归方程得到酿酒酵母最优培养条件为：培养温度23.74℃、培养时间71.44 h、培养基初始pH 6.53、菌龄12.11 h 时，酵母菌体干质量最高为29.72 g/L。

图5 培养基初始pH 和菌龄交互作用对酵母菌体干质量影响的响应面

2.2.2 模型验证 为了方便操作，将酿酒酵母培养条件修正为：培养温度23.5 ℃、培养时间71.5 h、培养基初始pH 6.5、菌龄12 h。在此条件下进行3 次平行验证试验，酵母菌体干质量平均值为（29.70±0.04）g/L，与预测值基本一致，说明模型可以较好地反映出酵母菌体干质量与培养条件变化关系的趋势（李莉等，2015）；同时，用酿酒酵母最优培养条件发酵较优化前提高了33.12%。

3 结论

本研究取酿酒酵母菌体干质量培养的重要条件进行单因素试验，筛选4 个重要影响因素，根据Box-Behnken 设计原理设计响应面试验，得出酿酒酵母最优培养条件为：培养温度23.5℃、培养时间71.5 h、培养基初始pH 6.5、菌龄12 h。在最优培养条件下，酵母菌体干质量达到（29.70±0.04）g/L，较优化前提高33.12%。