金纳米颗粒的特性及其应用于生物传感体系的研究进展*

严艳琴 综述,许永杰,张 华,△,莫 非,3 审校

1.贵州医科大学,贵州贵阳 550004;2.贵州省人民医院检验科,贵州贵阳 550002;3.贵州医科大学附属医院医务处,贵州贵阳 550004

金纳米颗粒(AuNPs)具有独特的理化性质,在生物检测和诊断方面具有巨大的应用价值[1]。AuNPs的特性适于多样化的传感应用,可通过调整其大小、形状和表面修饰配体等,进而调节AuNPs与生物靶标的相互作用,检测生物样本中不同类型分析物[2]。本文主要对AuNPs的性质、合成方法、表面功能化,以及AuNPs在生物传感领域的研究进展进行综述。

1 AuNPs的特性、合成及表面功能化

1.1AuNPs的特性

1.1.1局域表面等离子体共振(LSPR)特性 LSPR是指AuNPs表面自由电子的震荡频率与入射光的频率一致时产生共振,从而引起光被吸收的现象,导致了AuNPs的不同颜色变化[3]。几十纳米大小的球形AuNPs,其典型的LSPR吸收峰为515～560 nm,而且LSPR可以在很宽的波长范围内进行调谐,从可见光到近红外区域[4]。AuNPs尺寸、形状和表面功能化、粒子间距离的变化很容易将LSPR吸收峰转移到光谱的其他区域,引起颜色的明显改变[5],使人们够通过比色检测分析物。

1.1.2表面增强拉曼散射(SERS)特性 SERS即利用特定波长的光源照射局域表面等离激元所产生的局部增强的电磁场,放大拉曼散射信号[6]。AuNPs在可见光和近红外区域存在LSPR带,被广泛用作SERS基底。SERS强度呈现距离依赖性,离表面较远的电磁场呈指数衰减,使得信号增强限制在离基底表面较近的地方。因此,位于AuNPs表面热点的分析物,其拉曼信号将受到明显增强[7]。

1.1.3荧光淬灭和荧光增强特性 AuNPs在特定波长入射光激发下产生LSPR现象。其LSPR吸收带通常与荧光基团发射光谱重叠,在近距离(<5 nm)时,AuNPs通过荧光共振能量转移作用淬灭靠近的荧光基团[8]。随着荧光基团与AuNPs之间距离的增加,能量转移呈指数衰减。金属增强荧光是由于金属纳米结构表面等离激元被入射光激发导致局部电磁场的增强,进而提高荧光基团的激发速率和发射速率,使荧光增强[9]。在阈值距离(10～30 nm)内,荧光增强程度达到最大。当距离大于此阈值时,增强电场随距离的增加呈指数衰减,荧光增强程度会下降,直到在非常远的距离达到其原始荧光强度[10]。

1.1.4导电特性 AuNPs具有优异的电子转移能力。氧化还原反应消耗或产生离子或电子,AuNPs被用于增强电极与氧化还原物质之间的电子转移速率,电子快速转移到电极表面,使传感器具有较快的响应速度[11]。AuNPs具有较大的比表面积和良好的导电性能,能促进反应物的氧化还原反应,有效提高响应信号的信噪比和检测灵敏度,被广泛应用于电化学传感技术[12]。

1.1.5生物相容性 金属在生物体中的毒性主要是由于金属阳离子的形成而损伤细胞膜。金具有高还原电位而相对稳定,与其他金属相比,它电离的可能性较小[13]。生物相容性是促进其在体内成像、示踪及治疗应用的前提。AuNPs的表面功能化为改善生物相容性和与细胞的反应性提供了良好策略。

1.2AuNPs的合成 AuNPs合成最常用的方法是柠檬酸还原法。柠檬酸盐还原法是TURKEVICH等[14]在1951年提出的,即通过柠檬酸三钠还原氯金酸HAuCl4合成AuNPs,其中柠檬酸盐的作用是将Au3+还原为Au,同时通过静电排斥稳定纳米颗粒并防止团聚。FRENS[15]在此基础上进一步优化,通过改变柠檬酸盐的浓度来控制纳米颗粒的大小。为了合成更稳定分散的AuNPs,其他合成方法逐渐发展起来。不同的方法具有各自的优势和局限性。比如Brust-Schiffrin法[16]利用硼氢化钠还原金离子,可在两相溶液中产生稳定的AuNPs。电化学法[17]操作简单、易合成形状大小可控的AuNPs。激光烧蚀[18]可以产生粒径低于10 nm的AuNPs,而且AuNPs的尺寸可以通过激光强度来控制。离子溅射法[19]可以在不使用液相的情况下合成AuNPs,这减少了来自溶剂的有毒残留物。通过化学方法合成AuNPs会产生危害生物和环境的有毒副产物。物理方法涉及使用高外力,条件要求比较高。绿色生物合成方法[20],即细菌、真菌、酵母菌等微生物通过生物还原金离子合成AuNPs,改变培养条件可以控制纳米颗粒的大小和形状,具有简单、无毒、环境友好、经济的优点。

1.3表面功能化 在生物检测平台中,AuNPs需要将其表面功能化,从而为特定的生物靶标提供识别元件。常见的表面功能化策略有共价和非共价方法。共价方法中,金硫键(Au-S)介导生物偶联最常见。含巯基(-SH)配体,如谷胱甘肽、二硫化物,可与AuNPs共价形成金硫键(Au-S)[21]。含氨基或羧基生物分子,如赖氨酸和精氨酸,也能与AuNPs共价结合[22]。非共价方法,包括静电相互作用和物理吸附。带正电荷聚合物聚乙烯亚胺功能化AuNPs,通过带电分子提供额外的静电排斥,阻止纳米颗粒聚集[23]。含有多个连续腺嘌呤的聚腺嘌呤(polyA)序列以高亲和力吸附AuNPs,能有效地阻断非特异性DNA-Au的结合,可以制备具有良好杂交能力的纳米偶联物[24]。其他分子也可用于提高稳定性,如聚乙二醇、硫辛酸、牛血清清蛋白[25]。表面易功能化使得AuNPs成为与多种分子官能化的良好支架,这在实现生物医学应用方面起着重要的作用。

2 AuNPs在生物传感体系中的应用

AuNPs在生物传感领域有着广泛的应用。其特性可用于构建多种类型的传感器,检测不同的靶标,如蛋白质、核酸、小分子、金属离子、细菌、外泌体等。

2.1基于AuNPs的比色传感体系 AuNPs比色传感是指基于调控AuNPs聚集引起胶体溶液的可见颜色变化。分散的球形AuNPs(直径1～50 nm)在溶液中呈酒红色,而聚集的AuNPs呈紫色。MOITRA等[26]利用反义寡核苷酸链修饰的AuNPs与靶标直接进行杂交引发AuNPs聚集,引起颜色改变,通过视觉检出新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RNA阳性病例,而不需要复杂的仪器。ZHU等[27]通过靶识别后的级联反应调控AuNPs聚散,靶标ATP识别适体后引起脱氧核酶(DNAzyme)序列同步组装,裂解底物DNA,使互补单链DNA(ssDNA)修饰的AuNPs无法交联而分散。基于吸附/解吸过程诱导AuNPs聚集是另一类常见的策略。GAN等[28]提出了一种基于适配体链捕获Cd2+诱导裸AuNPs聚集的比色分析方法,通过颜色快速识别Cd2+。SUN等[29]利用靶蛋白竞争性结合DNA,导致AuNPs表面DNA的解吸,裸AuNPs不耐盐聚集,使溶液呈现红到蓝的变化。通过不同的分子识别机制调控AuNPs组装,可形成简单的视觉检出策略。AuNPs在比色传感的应用也存在一些局限性,如非特异性吸附和灵敏度低的问题。为避免非特异性吸附,可考虑用配体封闭AuNPs的表面。针对低灵敏度,可在体系中偶联等温扩增或级联放大技术[30]。

2.2基于AuNPs的侧向流动检测(LFA) LFA是最常用的基于AuNPs的传感类型,由于试纸条LFA对分析物的简单和快速检测,在床旁检测(POCT)领域得到广泛的应用。传统的LFA通常利用抗体作捕获分子,抗体与靶抗原形成三明治结构,在检测线上形成红线。FREW等[31]用抗核衣壳蛋白抗体偶联150 nm AuNPs建立试纸条测试,检测SARS-CoV-2抗原,能在15 min内检出阳性样本。近年来,核酸探针代替抗体被用于设计LFA,用于靶核酸的定性和定量分析。XU等[32]将稳定的DNA四面体捕获探针放置在检测线上,其与靶催化组装的H1-H2双链、链酶亲和素修饰的AuNPs结合形成夹心复合物,检测外泌体微小RNA(miRNA)。此外,核酸适配体技术的快速发展扩展了LFA的检测范围,基于适体的LFA在小分子检测方面也显示了良好的应用前景。MAO等[33]设计了一个与适体序列互补的cDNA偶联的AuNPs探针,与目标啶虫脒竞争结合检测线上适体,最小检出浓度为0.33 ng/mL。GUO等[34]巧妙运用了T-Hg2+-T碱基对共轭,提出了基于胸腺嘧啶错配捕获AuNPs的LFA方法,用于检测Hg2+。AuNPs LFA通过简单的比色信号或裸眼视觉检出,具备快速简便的优势,灵敏度低是其主要缺陷。通过引入信号放大技术,改变AuNPs的大小或形状,开发荧光-LFA、SERS-LFA等新型方法,有助于提高灵敏度[35]。

2.3基于AuNPs的荧光传感体系 AuNPs可引起距离依赖性荧光淬灭或增强(近距离荧光淬灭,阈值距离外荧光增强),可通过靶识别精确组装AuNPs与荧光基团。CHOI等[36]将金半壳/聚苯乙烯纳米球表面修饰捕获ssDNA,其与靶DNA、荧光基团偶联的ssDNA形成夹心式杂交,通过等离子体激元增强荧光。随后较小的AuNPs被引入,淬灭吸附在其表面的未杂交ssDNA的背景荧光,使灵敏度提高约103倍。然而,精确控制AuNPs与荧光基团从淬灭到增强仍然是一个挑战。常见的策略是荧光基团置于AuNPs表面时被淬灭,远离AuNPs表面荧光即恢复。该策略结合DNA walker高效的信号放大功能,可显著提高检测灵敏度。TAN等[37]利用DNAzyme序列组成的walker,循环切割AuNPs表面探针产生荧光信号,检测尿嘧啶-DNA糖基化酶。ZHOU等[38]用walker链与AuNPs表面荧光探针杂交,触发Nb.BbvCⅠ蛋白酶切割释放荧光信号并驱动walker位移,检测外泌体。

相较于常见的荧光基团,碳量子点(CQD)等新兴的纳米材料,在光稳定性、低细胞毒性和生物相容性方面具有明显优势[39]。基于CQD和AuNPs的荧光共振能量转移系统适合用于复杂样品分析。SHI等[40]通过脱落酸ABA-适体识别结合触发AuNPs的聚集,阻碍了AuNP与CQDs之间的能量转移过程,导致荧光淬灭。

2.4基于AuNPs的电化学传感体系 在电化学传感器中,AuNPs可以通过促进电子转移、固定生物分子、标记生物分子等方式发挥作用。常见的策略可分为两类,一类是将AuNPs沉积在基底表面,另一类是通过靶分子结合事件将AuNPs固定在传感器表面[41]。AuNPs沉积在电极表面,为核酸、抗体等识别元件固定提供了位点,通过促进电子转移放大电化学信号。ALAFEEF等[42]将AuNPs沉积在石墨烯表面,修饰ssDNA的AuNPs与SARS-CoV-2 RNA特异性结合,可在5 min内输出电化学信号。ROBERTS等[43]将AuNPs滴注到氧化锡电极上用作信号放大器,并固定特异性抗体以检测SARS-CoV-2 S1抗原。AuNPs通过靶标结合事件固定到传感器表面是另一种方式。AuNPs表面通常标记电活性物质和酶,标记的酶可催化底物水解成可溶性电活性产物,实现电化学反应信号检测[44]。HU等[45]将黏蛋白适体和辣根过氧化物酶HRP固定在AuNPs上,靶分子与适体结合后,导致AuNPs被捕获到传感器表面。HRP酶催化底物转化,检测电活性产物的信号。AuNPs标记电活性物质,是通过该物质直接转化为可测量的电化学信号。ZHANG等[46]针对外泌体设计3种特异性适体,外泌体结合电极表面适体,同时结合适体修饰的AuNPs,以AuNPs表面亚甲蓝和二茂铁为信号单元,检测乳腺癌外泌体。研究AuNPs在电极表面发生反应的机制以及如何增强其电催化性能,将有助于设计更有效的电化学传感器。

2.5基于AuNPs的SERS传感体系 AuNPs作为高灵敏度和更可控的SERS基底,被广泛应用于SERS传感领域。SERS可分为非标记分析和标记分析。非标记分析即SERS基底上不需要标记分析物,检测AuNPs表面天然分析物的SERS信息[47]。FRAIRE等[48]在外泌体囊泡表面官能化AuNPs,通过SERS信号鉴定单个外泌体类别,并在原位生长银层形成Au@AgNPs,消除AuNPs表面配体产生的干扰信号,从而得到清晰的生物结构的SERS光谱指纹。标记分析是指AuNPs表面可标记或吸附拉曼信号分子。CAMACHO等[49]设计了一种增强拉曼散射的壳核纳米结构,该结构由AuNPs和涂覆有尼罗蓝(拉曼报告子)的二氧化硅壳组成,壳层有效减少了背景信号的干扰,通过在其表面修饰抗体,可检测低至10 ng/mL的寨卡病毒NSl抗原。由于生物样品的复杂性,强背景干扰成为SERS技术应用于核酸检测的主要限制。PAN等[50]依据Au@Ag核壳纳米粒子与Fe(CN)64-的独特拉曼峰检测靶DNA,最终显示为未受背景干扰的SERS信号。

SERS基底上的热点分布极不均匀,局部增强的电磁场主要集中在纳米间隙和尖端等区域。可通过合理设计纳米间隙,在纳米组件之间产生增强的热点,如利用DNAzyme裂解底物使AuNPs接近金薄膜产生热点检测Pb2+[51]。如何构建高密度、分布均匀的热点,实现热点中拉曼分子的有效富集,是SERS面临的重要挑战[52]。

2.6基于AuNPs的电化学发光传感体系 电化学发光(ECL)是由电化学反应引发化学发光的现象。ECL效应取决于AuNPs与ECL发光载体之间的距离。近距离时,发光载体的ECL与AuNPs发生共振能量转移导致ECL淬灭效应;在远点的距离(<10 nm),AuNPs独特的LSPR诱导的增强电磁场可以增强ECL载体的发射,从而增强信号[53]。BROWN等[54]在电极表面沉积AuNPs,AuNPs可明显增加电活性面积,促进目标吉西他滨的电催化氧化,使ECL信号强度增加了60倍。VILLA等[55]利用铂涂层的金核纳米颗粒与[Ru(bpy)3]2+发生ECL共振能量转移,检测SARS-CoV-2病毒N蛋白,显示出低检测限和宽线性响应范围。为更好地实现ECL增强效应,需考虑如何精确控制AuNPs与发光载体的距离、改善识别元件在电极表面的分布等问题。

2.7基于AuNPs的其他传感体系

2.7.1光纤LSPR传感 光纤LSPR传感器是将AuNPs放置在光纤截面上,利用光纤产生的倏逝场激发AuNPs形成LSPR,AuNPs表面结合事件会导致周围介质折射率的增加,引起LSPR吸收峰强度变化[56]。KIM等[57]将抗体偶联的球形AuNPs附着在光纤表面,靶抗原与抗体反应引起光纤上AuNPs与游离AuNPs之间的耦合,导致LSPR信号改变。NING等[58]基于靶DNA催化的杂交链式反应组装大量AuNPs,与“Ω”形光纤表面的AuNPs探针杂交,LSPR信号明显增强。光纤LSPR传感仅依赖于紫外吸收光谱仪读数,具备无标记、小型化、快速的优点。

2.7.2光热传感 光热传感检测是基于AuNPs产生的光热效应。LSPR现象使AuNPs产生较高的光吸收,聚集态AuNPs表现出较强的光热转换效应[59],使生物标记物的信息转换为光热信号,结合温度计即可进行定量检测。靶标引入诱导AuNPs聚集是常见的策略,结合AuNPs表面不同的偶联物,可以检测不同靶标,如结核分枝杆菌DNA[60]、胰蛋白酶[61]。光热传感平台,选择温度作为信号读数,具有成本低、操作方便、背景低等优点,有应用于POCT的潜力。

2.7.3光电化学(PEC)传感 PEC传感的原理是光敏材料在吸收光后被激发产生电子空穴对,导致电荷分离和电荷转移形成光电流[62]。在PEC过程中,AuNPs因LSPR效应会明显增加光吸收,增强电荷分离,从而提高PEC性能[63]。例如在金属蛋白酶的检测中,AuNPs被沉积到光敏电极表面,为识别元件提供固定位点的同时提高光电转换效率[64]。因光激发源与电化学响应信号分离,PEC传感具有良好的信噪比和灵敏度。

3 展 望

快速、灵敏、准确、低成本的检测方法一直是人们关注的问题。新型传感模式和纳米材料(特别是AuNPs)为解决这些问题提供了策略。基于AuNPs在光、电及生物相容性方面的优势,其应用不仅限于生物传感,可以为疾病的诊断和治疗开辟更多新的途径,包括药物靶向输送及肿瘤的成像与治疗等。AuNPs可与其他材料结合制成杂化材料,如金属氧化物、聚合物、脂质、无机材料、金属有机骨架等[65],该杂化物具有物理或化学的协同效应或具有新的功能,因而应用范围更广泛,已用于药物递送、体外诊断、生物成像等各种领域。尽管基于AuNPs的体外诊断应用的研究已取得了很大的进展,但仍有一些关键问题有待解决,例如如何保证AuNPs分析平台的可重复性、可靠性、AuNPs的均一性等。总之,AuNPs技术具有广阔的应用前景,通过不断优化应用条件,可使其在生物医学领域发挥更大的应用价值。