ST11肺炎克雷伯菌QL5株携带的质粒pQL5-NDM-KPC的研究

马超越,王 笑,刘真真,贾 楠,朱元祺*

(1.青岛大学附属医院,山东 青岛266003;2.枣庄市山亭区人民医院,山东 枣庄277200)

在我国,肠杆菌目细菌对碳青霉烯类耐药主要是产KPC(肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶)或NDM(新德里金属β-内酰胺酶)酶[1-2]。前者由blaKPC基因编码,而后者为blaNDM基因[2]。目前,在同一株菌中同时检测到多个不同的碳青霉烯酶耐药基因的报道逐渐增多,且不同的碳青霉烯酶基因往往位于不同的质粒上[2-3],但对这些不同的碳青霉烯酶耐药基因位于同一个质粒上的报道较少。本文主要是对一株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌QL5临床株携带的blaNDM-1和blaKPC-2基因位于同一个质粒上(命名为pQL5-NDM-KPC)进行研究,现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验菌株耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌QL5株分离自住院患儿。沙门菌H9812为分子量标记;叠氮钠耐药的大肠埃希菌J53AziR为质粒液相接合受体菌(E.coliJ53AziR)。以上菌株为本实验室保存。

1.3 质粒的S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳(S1-PFGE)实验步骤参照相关文献报道方法[4]。

1.4 质粒的液相接合试验接合受体菌为大肠埃希菌J53AziR,供体菌为肺炎克雷伯菌QL5株,试验步骤参照文献进行[4]。

1.6 菌株的测序基于二代Illumina和三代Nanopore技术平台测序,获得菌株的染色体和质粒序列。然后,利用一系列软件分析菌株的基因组和质粒的生物学信息,如MLST分型依据在线网站https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/进行;注释用Rast (2.0);耐药基因用ResFinder(4.1);质粒分型用PlasmidFinder(2.1)。

2 结果

2.1 菌株的碳青霉烯酶检测结果

图1 肺炎克雷伯菌QL5株和丢失子(QL5ds株)的碳青霉烯酶检测图

2.2 质粒的液相接合试验、稳定性试验和S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳结果

大肠埃希菌J53AziR与肺炎克雷伯菌QL5株进行液相接合,未获得接合子。质粒的稳定性试验显示QL5株在传代第五天丢失了blaNDM基因,只携带blaKPC基因,命名这个丢失子为肺炎克雷伯菌QL5ds株(该菌株的碳青霉烯酶检测见图1)。继续传代至第30天,仍然仅仅携带blaKPC基因。随后,对肺炎克雷伯菌QL5株和丢失子(肺炎克雷伯菌QL5ds株)进行S1-PFGE,结果显示两个菌株携带的质粒数目不变,但QL5ds株携带最大的质粒略小于QL5株携带的那个质粒,S1-PFGE结果详见图2。

图2 S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳图

2.3 肺炎克雷伯菌QL5株与丢失子(肺炎克雷伯菌QL5ds株)的测序和生信分析结果

基于Illumina和Nanopore测序平台,获得了肺炎克雷伯菌QL5株和QL5ds株(传代第5天丢失了blaNDM基因)的基因组和质粒序列。生信分析显示:①菌株的多位点序列分型(MLST)是ST11。②肺炎克雷伯菌QL5株和QL5ds株都携带了两个质粒,其大小与S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳图相一致。③肺炎克雷伯菌QL5株携带了blaNDM-1和blaKPC-2基因,且这两个碳青霉烯酶基因位于同一个IncC/IncFII(PHN7A8)/IncR杂合质粒上(该质粒被命名为pQL5-NDM-KPC,获得的GenBank 序列号为OR253888)。④QL5ds株携带的大质粒(丢失了blaNDM-1基因,但blaKPC-2存在)被命名为pQL5ds-KPC;与pQL5-NDM-KPC相比较,pQL5ds-KPC是缺少了blaNDM-1基因所在的区域,即肺炎克雷伯菌QL5株经传到第五代发生了片段丢失事件,而不是整个质粒的丢失;这个丢失片段长度为10 494 bp,其结构为dsbD-trpF-bleMBL-blaNDM-1-ΔISAba125-IS26-In27-ISCR1。⑤肺炎克雷伯菌QL5株除了携带blaNDM-1和blaKPC-2基因外,还携带多个不同种类的耐药基因,如喹诺酮类和氨基糖苷类等耐药基因,并与呈现的多重耐药表型相符合。

肺炎克雷伯菌QL5株和QL5ds株基因组和质粒序列的长度、G+C含量、复制子类型和携带的耐药基因详见表1。

表1 肺炎克雷伯菌QL5株和QL5ds株的生信分析结果

3 讨论

多β-内酰胺酶的产生可发生在所有产生β-内酰胺酶的革兰氏阴性菌中,但在产生碳青霉烯酶的多重耐药菌中尤其明显[5]。本研究的肺炎克雷伯菌QL5株除了携带的blaNDM-1和blaKPC-2碳青霉烯酶基因位于同一个IncC/IncFII(PHN7A8)/IncR杂合质粒上外,还携带多个其他β-内酰胺类抗性基因,如blaCTX-M-65、blaTEM-1B、blaSHV-12、blaSHV-182和blaOXA-1基因。此外,QL5株还携带其他抗性耐药基因,包括氨基糖苷类抗性基因[aac(6′)-Ib-cr、aadA2、aac(3)-IId]、磺胺抗性基因(sul1)、甲氧苄啶抗性基因(dfrA12)和大环内酯抗性基因[mph(A)]等,与呈现的多重耐药表型相符合。

目前,更令人关注的是在同一细菌中多种碳青霉烯酶的共同产生,而且这些多种碳青霉烯酶的联合出现会有地域上的差别。国外的研究表明[1,6-7],自2008年以来,KPC酶与另一种碳青霉烯酶在至少110株分离株中联合出现,而OXA-48相关的碳青霉烯酶在130多株分离株的碳青霉烯酶组合中被发现。与其他碳青霉烯酶相比,KPC β-内酰胺酶更有可能与VIM 型金属酶联合产生(占比75%的分离株),且这些分离株主要来自美洲和希腊。仅有较少的分离株与NDM-1(7%)、IMP(6%)或OXA-48(6%)碳青霉烯酶共同产生KPC酶。这与国内的报道不同[2]。另外,与OXA-48型酶共产生最多的碳青霉烯酶是金属酶。在这些分离株中,产生NDM型碳青霉烯酶占81%。同样,当NDM型酶与其他碳青霉烯酶共产生时,90%的分离株中存在OXA-48型酶,其次是IMP(5%)和KPC(4%)[1,6-7]。

虽然许多共同产生碳青霉烯酶的细菌是肺炎克雷伯菌分离株(60%),但在其他肠道细菌中也有双碳青霉烯酶产生的报道,包括弗氏柠檬酸杆菌(4.1%)、肠杆菌(3.7%)、产酸克雷伯菌(0.9%)和黏质沙雷菌(11.1%)[1,7-8]。另外,最近从在印度医院就诊的一位美国患者中还分离出同时携带NDM、VIM和OXA-48三个编码基因的肺炎克雷伯菌[9]。目前,产碳青霉烯酶的细菌可同时携带多黏菌素耐药基因,这使临床对抗感染的治疗面临更多的困难[10]。

在抗生素选择压力下,细菌除了同时产生多种不同的碳青霉烯酶外,也可呈现同一基因的多个拷贝。在对肺炎克雷伯菌QL5株的序列分析中发现,blaNDM-1基因区域(10kb)存在大片段重复和重复片段数目的异质性,即在单个质粒(pQL5-KPC-NDM)中呈现了blaNDM-1基因的1～5个拷贝(单片段长度为10 494 bp),而blaNDM-1多拷贝与单个拷贝的质粒相比,就是10 494 bp片段(dsbD-trpF-blaMBL-blaNDM-1-ΔISAba125-IS26-In27-ISCR1)的重复复制。另外,质粒的稳定性试验和生信分析显示,肺炎克雷伯菌QL5株经传代发生了片段丢失,不是整个质粒的丢失,而且这个丢失片段长度也为10 494 bp,其结构与前述的重复片段完全相同(也为dsbD-trpF-blaMBL-blaNDM-1-ΔISAba125-IS26-In27-ISCR1),即杂合质粒pQL5-KPC-NDM的形成和多样性与移动元件ISCR1有关。

以上结果提示,通过片段序列的同源重组可实现质粒的异质性,这可能是质粒进化方式,也对产多碳青霉烯酶肠杆菌目细菌的耐药机制研究有一定的意义。另外,经检索,肺炎克雷伯菌QL5株携带的质粒pQL5-NDM-KPC属于一个新型的IncC/IncFⅡpHN7A8/IncR杂合质粒(GenBank 序列号:OR253888),目前尚未见报道。