宁夏地区葡萄炭疽病病原菌鉴定及生物学特性研究

蒋朝阳 于泽洋 杨花 顾沛雯

摘 要 为明确宁夏地区葡萄炭疽病的病原菌种类及其生物学特性差异，于2022年6月至10月对宁夏地区葡萄炭疽病病样进行采集分离，通过形态学鉴定、致病性测定和多基因系统发育分析，确定其病原菌种类；通过测定不同菌株菌丝生长及产孢量确定最优碳氮源、最适pH及致死温度。研究表明，宁夏地区葡萄炭疽病的主要病原为毁灭炭疽菌（Colletotrichum destructivum）、果生刺盘孢（C. fructicola）和暹罗刺盘孢（C. siamense）。毁灭炭疽菌最适菌丝生长和产孢的碳源为可溶性淀粉和葡萄糖，氮源为蛋白胨和乙酸铵；果生刺盘孢最适菌丝生长和产孢的碳源为麦芽糖和蔗糖，氮源为酵母膏和胰蛋白胨；暹罗刺盘孢最适菌丝生长和产孢的碳源为可溶性淀粉，氮源为乙酸铵和蛋白胨。各菌株均在pH为4～10时生长良好，致死温度均为  52 ℃。500 g/L氟啶胺悬浮剂对暹罗刺盘孢和果生刺盘孢抑菌活性最佳，EC50值分别为0.324 4 μg/mL和  0.386 9 μg/mL。综上，毁灭炭疽菌、果生刺盘孢和暹罗刺盘孢是葡萄炭疽病的主要病原菌，且不同炭疽菌菌种间生物学特性差异较大，该结论可为葡萄炭疽病的有效防治提供理论依据。

关键词 葡萄炭疽病菌；种类鉴定；系统发育分析；生物学特性

由炭疽菌属（Colletotrichum spp.）真菌导致的炭疽病是葡萄生产中的重要病害，在世界范围内葡萄产区广泛发生。该属真菌可侵染果实、叶片和枝条等部位，引起果实腐烂、枝条枯死等症状，也是葡萄贮藏期的主要病害之一，而葡萄转色至成熟期因具有较高的含糖量，更易被炭疽菌侵染，造成果实的腐烂[1]。目前，中国已报道的葡萄炭疽病主要病原菌有葡萄炭疽菌（Colletotrichum viniferum）、胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）[2]、隐秘刺盘孢（C. aenigma）、河北炭疽菌（C. hebeiense）[3]、C. citri、C. cliviae、果生刺盘孢（C. fructicola）[4]、C. capsici和平头炭疽菌（C. truncatum）[5]等。国外报道的葡萄炭疽病主要病原菌有果生刺盘孢（C. fructicola）、卡哈瓦炭疽菌（C. kahawae）、葡萄炭疽菌（C. viniferum）、C. limitticola、睡莲炭疽菌（C. nymphaeae）、喀斯特炭疽菌（C. karstii）[6]、松针刺盘孢（C. fioriniae）[7]、C. perseae[8]和尖孢炭疽菌（C. acutatum）[9]等，其病原种类呈现多样化，不同国家地区之间差异较大。

近年来，宁夏地区随着葡萄种植面积扩大，种植年限的延长，葡萄炭疽病发生逐年加重，严重影响了葡萄的产量与品质。葡萄炭疽病在田间的发病症状相似，但其病原种类存在差异，导致药剂防治效果较差，严重影响该地区葡萄产业的快速发展。因此，弄清葡萄炭疽病病原种类、生物学特性及发生条件对于科学精准防治具有重要的指导意义。本试验旨在探究宁夏地区鲜食和酿酒葡萄炭疽菌种类，着重研究侵染葡萄不同炭疽病病原菌种间的生物学特性差异，以期为葡萄炭疽病发病规律及病害的科学防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 葡萄炭疽病病原菌的分离与鉴定

1.1.1 葡萄炭疽病样品的采集及分离 2022年6至10月，在宁夏地区温室、大田采集发病症状较为明显的果实及叶片样品，其中葡萄果实（14份）及叶片（10份），置于4 ℃冰盒带回实验室。采用组织分离法对葡萄炭疽病病原菌进行分离并接种至PDA培养基，26 ℃培养7 d，用灭菌接种针从菌落边缘挑取少量菌丝接种至新的PDA培养基内进行纯化培养。纯化菌株转接至PDA斜面培养基中，4 ℃保存备用。

1.1.2 分离物致病性测定 选用健康无伤的酿酒葡萄‘赤霞珠叶片和鲜食葡萄‘维多利亚果实，将叶片及果实表面消毒后，采用针刺接种菌饼的方法将病原菌接种于叶片及果实伤口处，再放入铺有湿润无菌滤纸的培养皿内进行保湿培养。以接种无菌的PDA培养基块为对照，26 ℃恒温保湿培养，7 d后观察发病情况，测量病斑直径。

1.1.3 病原菌形态学鉴定 从培养5 d的菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，接种至PDA平板中央，26 ℃培养7 d，观察并记录菌落形态特征。从培养5 d的菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，接种至合成低营养琼脂（SNA）培养基和水琼脂（WA）培养基平板中央，以菌饼为中心，在其四周对称放置4块无菌盖玻片，置于26 ℃培养箱培养7～10 d，对菌丝附着胞及分生孢子附着胞进行诱导及观察。

1.1.4 病原菌的分子生物学鉴定 选择代表性菌株及GQ1-3（松针刺盘孢 C. fioriniae，枸杞）、HL1-4（四川炭疽菌 C. sichuanense，火龙果）、LH2-5（C. cymbidiicola，兰花）和XJ2-6（普氏炭疽菌 C. plurivorum，香蕉）4株外源炭疽菌菌株（保存于宁夏大学农学院病理实验室）。采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生物工程有限公司）提取DNA，扩增ITS、ACT、  CHS1和  TUB2基因序列，由生物工程（上海）有限公司对PCR产物进行基因测序。以实验室分离炭疽菌菌株为外源菌，通过NCBI-BLAST进行同源序列比对，并下载相关同源序列，采用Mega 7.0和PhyloSuite V1.2.2软件对ITS、ACT、  CHS1、  TUB2联合序列构建系统发育树，建树方法采用邻接（Neighbor-Joining）法，Bootstrap   1 000次重复。

1.2 葡萄炭疽菌的生物学测定

1.2.1 碳源和氮源对菌丝生长及产孢量的影响 选择查氏（Czapek）培养基为基础培养基。分别用等质量的果糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和甘露醇替代Czapek培养基中的蔗糖，配制成不同碳源的培养基，以不含碳源的Czapek培养基为空白对照。分别用等质量的硝酸钾、酒石酸钾钠、草酸铵、乙酸铵、磷酸二氢钾、甘氨酸、蛋白胨、酵母膏及胰蛋白胨替代Czapek培养基中的硝酸钾，配制成不同氮源的培养基，以不含氮源的Czapek培养基为空白对照。接种后26 ℃倒置培养，5 d后用十字交叉法测量菌落生长直径，14 d后用5 mL无菌水冲洗菌落，用血球计数板测定产孢量，每个处理重复3次。

1.2.2 pH对菌丝生长及产孢量的影响 用  0.1%的HCl溶液和NaOH溶液调节PDA培养基的pH至4、5、6、7、8、9和10，将5 mm的菌饼接种于不同pH的PDA平板中央，每个处理重复3次。接种和测定方法同“1.2.1”。

1.2.3 菌株致死温度的测定 参考李继平等[10]的方法。打取5 mm菌饼放入5 mL离心管内，加入4 mL无菌水，分别在34、37、40、43、46、49、52、55和58 ℃恒温水浴加热处理15 min，每个处理重复3次，然后将菌饼取出，接种于PDA平板中央，26 ℃倒置培养，每个处理重复3次，菌落生长直径的测量方法同“1.2.1”。

1.2.4 化学药剂对葡萄炭疽病病原菌的抑菌活性 选择3种常见化学药剂分别为500 g/L氟啶胺悬浮剂、430 g/L戊唑醇悬浮剂和10%苯醚甲环唑水分散粒剂，均购自山东邹平农药有限公司。采用菌丝生长速率法测定3种化学药剂对葡萄炭疽病菌菌丝生长的影响。根据预试验结果，将3种药剂分别配置为1×103 μg/mL母液，稀释为质量浓度为100、10、1、0.1和0.01 μg/mL的药液，然后与PDA培养基以体积配比1∶9的比例，配制成终质量浓度为10、1、0.1、0.01、和0.001 μg/mL的含药培养基，以等量的无菌水为对照（CK），每个处理重复3次。将5 mm的病原菌菌饼接种于不同浓度梯度的PDA平板中央，25 ℃培养，5 d后采用十字交叉法测量菌落直径（cm），计算各浓度处理下药剂对菌丝生长的抑制率。

抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%

1.3 数据分析

通过SPSS  19.0软件对试验数据进行处理和统计分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。用DPS  13.0对化学药剂浓度对数值和相应抑制率机率值进行回归分析，计算毒力回归方程、相关系数、EC50和置信区间。

2 结果与分析

2.1 葡萄炭疽菌的分离与鉴定

2.1.1 葡萄炭疽菌的采集及分离 2022年6至10月，对宁夏地区发病症状较为明显的葡萄果实及叶片样品24份进行分离纯化，获得纯化菌株24株。根据具体菌落性状、分生孢子盘、分生孢子及附着胞等具体形态特征，将24株菌株划分为3个形态类型（图1）。

形态Ⅰ：菌落正面呈白色至淡粉色，背面呈黄色至黄棕色，气生菌丝绵密；分生孢子盘具刚毛；分生孢子一端较尖，一端钝圆，中段偶有缢缩，大小约（9.34～15.58）  μm×（2.67～4.11）  μm；菌丝附着胞及分生孢子附着胞近纺锤状或不规则状，褐色。分离于葡萄‘维多利亚果实，分离占比  8.3%，代表菌株为NX1-1。形态Ⅱ：病原菌菌落初期灰白色，产生橙黄色分生孢子堆；分生孢子两端钝圆，中间有1～2个油球，大小约（8.68～  11.53）μm×（3.27～5.11）μm；菌丝附着胞纺锤状，分生孢子附着胞呈卵圆形，褐色至黑褐色，边缘规则，偶有不规则状。分离于葡萄‘维多利亚果实，分离占比50.0%，代表菌株为NX1-3。形态Ⅲ：病原菌菌落灰白色，菌丝致密，边缘整齐，呈圆形，表面着生气生菌丝，产生橘黄色分生孢子堆；分生孢子圆柱形或梭形，部分中部有溢缩，大小约（7.57～12.64）μm×（2.22～4.78）μm；附着胞呈不规则状，褐色至黑褐色。分离于葡萄‘赤霞珠叶片，分离占比41.7%，代表菌株为NX2-7。

2.1.2 分离菌株致病性测定 采用刺伤接种法对供试的3株代表性菌株进行致病性测定，发现3株菌株均可侵染‘赤霞珠叶片和‘维多利亚果实，进一步分离纯化后，再分离物与接种菌株一致。果实刺伤接种病原菌7 d后，果粒均出现棕色至黑褐色病斑，NX1-3和NX2-7果粒出现塌陷，菌饼周围病斑表面轮生少量黑色凸起子囊盘，潮湿条件下NX1-1、NX1-3与NX2-7出现少量橘粉色分生孢子堆（图1-A7、图1-B7和图1-C7）。其中，NX1-3和NX2-7病斑直径显著大于NX1-1，分别为11.2 mm和10.8 mm，在果实上表现为强致病力，NX1-1致病力较弱，病斑直径为  7.50 mm（表1）。叶片刺伤接种7 d后，叶片表面出现深褐色近圆形病斑，NX1-1、NX1-3和NX2-7菌饼周围病斑表面轮生少量黑色凸起子囊盘，NX1-1、NX1-3与NX2-7出现少量橘粉色分生孢子堆（图1-A8、图1-B8和图1-C8）。其中，NX2-7在葡萄‘赤霞珠叶片上表现强致病力，病斑直径为18.67 mm；NX1-1致病力最弱，病斑直径为  9.67 mm（表1）。

2.1.3 病原菌分子生物学鉴定 对分离获得的3株代表性菌株以及4个外源菌株的4个基因位点进行PCR扩增，分别获得4条不同长度的目的基因片段ITS为550 bp、ACT为280 bp、  CHS1为300 bp和  TUB2为740 bp。将获得的序列经校对后提交至GenBank，共获得28个GenBank序列登录号。供试菌株的来源及其目的片段序列的详细信息如表2所示。

将测试菌株的目的片段序列在NCBI网站进行BLAST比对，下载参考菌株的目的位点序列，与测试的7个炭疽菌菌株的目的位点序列构建多位点系统发育树（图2），以C. curcumae IMI 288937作为外群。结果显示，NX1-1与C. destructivum聚在同一分支上；NX1-3与C. fructicola聚在同一分支上；NX2-7与C. siamense聚在同一分支上。结合形态学观察结果，毁灭炭疽菌（C.destructivum）的菌落形态表现为形态Ⅰ；果生刺盘孢（C. fructicola）表现为形态Ⅱ；暹罗刺盘孢（C. siamense）表现为形态Ⅲ。

2.2 病原菌生物学特性比较

2.2.1 碳源对菌丝生长及产孢量的影响 由表3可知，代表菌株在不同碳源培养基上均能生长，但菌丝生长量和产孢量差异显著。毁灭炭疽菌以可溶性淀粉为碳源的培养基上菌丝生长最好，菌落直径为6.08 cm，以葡萄糖为碳源的培养基上产孢量最好，产孢量为0.65×106  mL-1；果生刺盘孢在以麦芽糖为碳源的培养基上菌丝生长最好，菌落直径可达7.32 cm，以蔗糖为碳源的培养基上产孢量最高，产孢量可达6.83×106  mL-1；暹罗刺盘孢在以可溶性淀粉为碳源的培养基上菌丝和孢子均生长良好，菌落直径和产孢量分别为6.40 cm和7.12×106  mL-1。而其他碳源均不利于3株病原菌菌丝和孢子的生长。

2.2.2 氮源对菌丝生长及产孢量的影响 由表4可知，代表菌株在不同氮源培养基上均能生长，但菌丝生长量和产孢量差异显著。毁灭炭疽菌菌株在以蛋白胨为氮源的培养基上菌丝生长最好，菌落直径为7.00 cm，以乙酸铵为氮源的培养基上产孢量最高，产孢量为6.53×106  mL-1；果生刺盘孢在以酵母膏为氮源的培养基上生长最好，菌落直径为8.02 cm，以胰蛋白胨为氮源的培养基上产孢量最高，产孢量为12.18×106  mL-1；暹罗刺盘孢在以乙酸铵为氮源的培养基上菌丝生长最好，菌落直径为8.22 cm，在以蛋白胨为氮源的培养基上产孢量最高，产孢量达7.07×106  mL-1。而其他氮源均不利于3株病原菌菌丝和孢子的  生长。

2.2.3 pH对菌丝生长及产孢量的影响 如图3所示，不同pH条件对各菌株菌丝生长量和产孢量的影响不同，各菌株在pH为4～10时均能生长。毁灭炭疽菌在pH为8时菌丝生长良好，菌落直径为4.80 cm，pH为9时产孢量最高，为  0.70×106  mL-1；果生刺盘孢菌丝生长与产孢量均在pH为7时达到峰值，分别为7.43 cm和  4.33×106  mL-1；暹罗刺盘孢于pH为5时菌丝生长最好，菌落直径为7.90 cm，pH为6时产孢量达到峰值，为20.93×106  mL-1。

2.2.4 菌株致死温度的测定 由表5可知，经34 ℃～49 ℃水浴处理15 min后，3株供试菌株均能进行正常生长，温度升高至52 ℃时，毁灭炭疽菌、果生刺盘孢和暹罗刺盘孢均停止生长。

2.2.5 化学药剂对葡萄炭疽病病原菌的抑菌活性 由表6可知，3种化学药剂在一定浓度范围内均能抑制病原菌的菌丝生长。对暹罗刺盘孢和果生刺盘孢抑菌活性最好的化学药剂为500 g/L氟啶胺悬浮剂，EC50值分别为0.324 4 μg/mL和0.386 9 μg/mL；对毁灭炭疽菌抑菌活性最好的化学药剂为10%苯醚甲环唑水分散粒剂，EC50值为0.085 8 μg/mL。

3 讨  论

炭疽菌属（Colletotrichum spp.）真菌作为炭疽病的主要病原菌，其种类多、寄主范围广且遗传差异大，因不同的气候条件导致不同地区引起葡萄炭疽病的病原种类不一致。目前，中国江苏地区葡萄炭疽病病原菌主要以隐秘炭疽菌（C. aemigma）、葡萄炭疽菌（C. viniferum）和果生刺盘孢（C. fructicola）为主[4]；云南地区为胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、果生刺盘孢（C. fructicola）和葡萄炭疽菌（C. viniferum）等[11]；山东、河北等地为河北炭疽菌（C. hebeiense）等[1]，但宁夏地区葡萄炭疽病病原种类尚未见报道。本研究从宁夏地区具有典型炭疽病病斑的葡萄果实及叶片上共分离出24株菌株，通过形态特征与多基因系统发育分析相结合的方法，最终鉴定为3个种，分别为毁灭炭疽菌（C. destructivum）、果生刺盘孢（C. fructicola）和暹罗刺盘孢（C. siamense）。除果生刺盘孢（C. fructicola）外，毁灭炭疽菌（C. destructivum）和暹罗刺盘孢（C. siamense）为国内首次报道。果生刺盘孢（C. fructicola）、暹罗刺盘孢（C. siamense）所属的胶孢炭疽复合种[12]具有寄主广泛，致病性强等特点，在全球均有分布。其中，果生刺盘孢（C. fructicola）不仅能够引起葡萄炭疽病的发生，还可引起草莓[13]、樱桃[14]等多个重要经济作物炭疽病的发生；暹罗刺盘孢（C. siamense）虽在宁夏地区葡萄叶片上首次分离获得，但国内苹果[15]、梨[16]和草莓[17]等多个重要经济作物上均有报道，且是主要炭疽病病原菌之一；毁灭炭疽菌（C. destructivum）则易引起红心莲[18]和大豆炭疽病的发生[19]。结合致病性测定发现，暹罗刺盘孢（C. siamense）对葡萄果实及叶片的致病性显著强于果生刺盘孢（C. fructicola）和毁灭炭疽菌（C. destructivum），这与暹罗刺盘孢（C. siamense）对油茶[20]和草莓[21]致病性表现一致，且该菌是导致两者炭疽病发生的优势种群。因此，暹罗刺盘孢（C. siamense）的侵染可能是宁夏地区葡萄炭疽病发生严重的重要原因之一，生产上应对由该病原导致的葡萄炭疽病加强关注与防范。

病原菌的生物学特性与病害的发生和流行规律有着密切联系。本研究针对所分离的3株代表性菌株进行了生物学特性之间的比较研究。研究发现，3株菌株菌丝生长和产孢的最适碳源主要为果糖、可溶性淀粉和葡萄糖，同时，葡萄果实中的可溶性糖多以葡萄糖和果糖为主，说明含糖量较高的葡萄品种可能更易发病。在供试的氮源培养基上，各菌株均在蛋白胨、酵母膏和胰蛋白胨生长良好，而在以硝酸钾、酒石酸钾钠等无机氮源培养基上生长较差，这与广西降香黄檀炭疽病菌的生物学特性分析结果是一致的[22]，说明炭疽菌菌株对有机氮源的利用率更高。pH作为真菌与宿主相互作用的关键因素，可通过改变酶的活性，间接影响病原菌的毒力[23]。本研究结果表明，3株炭疽菌菌株在pH为4～10均能较好生长，毁灭炭疽菌（C. destructivum）在pH为8时菌丝生长较好，pH为9时产孢量达到峰值，这与董金龙[18]在红心莲上发现的毁灭炭疽菌最适pH一致；暹罗刺盘孢（C. siamense）于pH为5时菌丝生长最好，这与任立超等[24]认为暹罗刺盘孢（C. siamense）在较差环境下可能刺激其大量产孢的结论一致；果生刺盘孢（C. fructicola）菌丝生长与产孢均在pH为7时达到峰值，与闪瑶等[22]认为弱酸性条件下更适宜果生刺盘孢（C. fructicola）生长的结论略有差异，说明不同来源的同种病原菌在生物学特性方面存在一定的差异，究其原因可能与菌株寄主、地理来源、生态适应性等差异有关。温度也是影响真菌生长的重要因素之一，不适宜环境条件下会抑制菌株生长。3株炭疽菌均能在34～49 ℃下生长，毁灭炭疽菌（C. destructivum）、果生刺盘孢（C. fructicola）和暹罗刺盘孢（C. siamense）的致死温度则均为52 ℃，说明三者具有较强的耐高温性，高温年份应重点关注葡萄炭疽病的发生和防治。此外，500 g/L氟啶胺悬浮剂对3株葡萄炭疽病病原菌均具有较好的抑菌活性，EC50值介于0.324 4～0.386 9    μg/mL。马云云等[25]研究发现氟啶胺对40株供试炭疽菌菌丝生长有明显的抑制作用，EC50值介于0.028～0.53 mg/L，这与本试验结果一致。上述研究结果将为葡萄炭疽病的发生规律及病害防治提供理论依据

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Identification and Biological Characteristics of Colletotrichum Species Causing Anthracnose on Grapevine in Ningxia

JIANG  Zhaoyang， YU Zeyang， YANG Hua and GU Peiwen

（College of Agriculture， Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

Abstract To identify the pathogenic species and their biological characteristics of grape anthracnose in Ningxia， grape anthracnose samples were collected in Ningxia region from June to October 2022， the pathogens were isolated and identified through morphological identification， pathogenicity determination， and multi-gene phylogenetic analysis. The optimal carbon and nitrogen source， pH and lethal temperature were determined by measuring mycelial growth and spore production in different strains. The results demonstrated that the main pathogens of grapevine anthracnose in Ningxia were Colletotrichum destructivum， C. fructicola and C. siamense. The suitable carbon sources were soluble starch and glucose， and nitrogen sources were peptone and ammonium acetate for mycelial growth and spore production of C. destructivum. The optimal carbon sources were maltose and sucrose， and nitrogen sources were yeast paste and tryptone for mycelial growth and spore production of C. fructicola. The appropriate carbon sources were soluble starch， and nitrogen sources were ammonium acetate and peptone for mycelial growth and spore production of C. siamense. All strains grew well at pH 4-10. The lethal temperature was 52 ℃. The fungicide with the best bactericidal activity against C. siamense and C. fructicola was 500 g/L fludioxonil suspension. The EC50 values were 0.324 4 μg/mL for C. siamense and 0.386 9 μg/mL for C. fructicola. In this paper， Colletotrichum destructivum， C. fructicola and C. siamense are the main pathogens of grapevine anthracnose， and the biological characteristics of the different anthracnose strains differ greatly. The findings may provide a theoretical foundation for the effective control of grapevine anthracnose.

Key words Grapevine anthracnose; Species identification; Phylogenetic analysis; Biological characteristics

Received  2023-03-15    Returned 2023-06-30

Foundation item National Key R&D Program（No.2019YFD1002502）.

First author JIANG Zhaoyang， female， master student. Research area：resource utilization and plant protection.E-mail：Jiangzy@163.com

Corresponding   author GU Peiwen，female，professor，doctoral supervisor.Research area：phytopathology and biological control.E-mail：gupeiwen2019@nxu.edu.cn

（责任编辑：史亚歌 Responsible editor：SHI Yage）