蒲公英叶斑病病原分离鉴定与生物学特性研究

张自强 李继平 郑果 许彬彬 翟艳青 惠娜娜 王立 马娅楠

摘 要 为明确甘肃省定西市渭源县等地蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz）叶斑病病原菌及其生物学特性。采用组织分离法对病原菌进行分离，通过观察病原菌形态特征、柯赫氏法则致病性测定，并基于ITS、  TEF1、  rpb2基因序列分析，对病原菌进行鉴定。引起蒲公英叶斑病的病原真菌为细极链格孢（Alternaria tenuissima），其在 PSA培养基上长势最好；最佳生长碳源为葡萄糖，可溶性淀粉最适合产孢；最佳生长氮源为有机氮源蛋白胨；最适生长的 pH为 8；最适生长温度为 25 ℃。

关键词 蒲公英；叶斑病；细极链格孢；生物学特性

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.）别名黄花地丁、婆婆丁、华花郎等。菊科多年生草本植物[1]。

蒲公英可药食两用，是中国国家中药保护植物之一，主要分布在中国西南及华北等地[2-3]。因其具有易栽培、生长迅速等特点在中国甘肃等地果园中常将其当做绿肥。

近几年随着蒲公英在食用、医药以及农业领域受重视程度不断增加，市场对其质量要求也愈发严格。明确蒲公英各种病害，提升其质量成为切实需要解决的问题。

2022年6月，在甘肃省定西市渭源县发现一种蒲公英叶部病害。受侵染的植株叶片出现褐色斑点，形状圆形或近圆形，严重影响蒲公英的产量和质量。

据报道，蒲公英病害有锈病[4]、茎腐病[5]，但笔者未见国内外有关蒲公英叶斑病的详细报道。因此，本研究对甘肃省渭源县田间蒲公英病叶上分离到的病原菌，进行形态学鉴定、致病性测定以及基于  ITS、  TEF1、  rpb2基因序列分子生物学鉴定，同时测定其生物学特性，旨在明确其病原种类和发生规律，进而为蒲公英叶斑病的田间诊断和防治提供理论基础和参考依据。

1 材料与方法

1.1 蒲公英叶斑病病原菌的分离和纯化

蒲公英叶斑病样本采自甘肃省定西市渭源县。采用组织分离法[6]，对症状典型的叶片，用无菌水冲洗干净后，在超净工作台内晾干，用灭菌后的解刨刀在蒲公英叶片病健交界处切取5 mm×5 mm大小的组织块，用75%的酒精消毒30 s后，浸入5% NaClO中1～2 min，最后在无菌水中浸泡3次，晾干后接入PDA平板中，25 ℃恒温培养5 d，得到分离菌株。将得到的菌株连续纯化3次，得到的纯化菌株于4 ℃保存，备用。

1.2 病原鉴定

1.2.1 形态学鉴定 将接有病原菌的PDA平板放于25 ℃培养箱中5 d后，观察并记录菌落颜色、大小、轮廓形状，挑取菌丝制作玻片，在光学显微镜下观察病原菌菌丝以及孢子形态，参考真菌鉴定手册进行病原鉴定。

1.2.2 病原菌的致病性测定 根据柯赫氏法则[7]，采用离体叶片菌饼接种与孢子悬浮液喷洒进行测定。摘取健康的蒲公英叶片，用75%酒精表面擦拭消毒，用灭菌水冲洗干净待表面水分晾干，备用。

菌饼接种：用5 mm的打孔器在纯化好的菌落边缘打取菌饼，将菌饼接种于蒲公英叶片一侧，另一侧接无菌PDA作为对照，不进行刺伤处理。将处理过的叶片放入灭菌后的托盘中，用保鲜膜密封保湿，每天观察发病情况。出现病斑后进行重新分离纯化，与原菌株一致的为致病菌株。

孢子悬浮液接种：将纯化后的菌株培养7 d后，刮取菌落用无菌水稀释，后使用血球计数板统计孢子数量，配置成1×107 mL-1孢子悬浮液，并将其均匀喷洒在准备好的叶片上。将处理过的叶片放入灭菌后的托盘中，用保鲜膜密封保湿，每天观察发病情况。对出现的病斑进行重新分离纯化，与原菌株一致的为致病菌株。

1.2.3 分子生物学鉴定 将PDA培养基上  25 ℃恒温培养7 d左右的待测菌，用无菌接种刀刮取菌丝体于1.5 mL离心管中晾干，将晾干后的菌丝用液氮冷冻并研磨成粉末，-20 ℃冷冻保存，备用。DNA提取按照北京索莱宝科技有限公司生产的真菌基因组DNA提取试剂盒（Fungi Genomic DNA Extraction Kit）进行，将提取出的DNA于-20 ℃冷冻保存。

用ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）/ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）、TEF1-728F（CATCGAGAAGTTCGAGAAGG）/TEF1- 986R（ACTTGAAGGAACCCTTACC）、RPB2-5F（GAYGAYMGWGATCAYTTYGG）/fRPB2-7CR（CCCATRGCTTGYTTRCCCAT）[8-10] 3种引物对病原菌基因组进行PCR扩增，扩增体系为  25  μL：Taq Master Mix聚合酶12.5 μL，上、下游引物各  1 μL，DNA模板1.0 μL，无菌超纯水补充至  25 μL。PCR程序：94  ℃预变性5 min，   94  ℃变性40 s，58  ℃退火40 s，72  ℃延伸30 s，共35个循环，72  ℃延伸10 min，4  ℃保存。扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将测序结果在NCBI中比对，选择相关属种序列利用MEGAX构建系统发育树。

1.3 病原菌生物学特性

1.3.1培养基对病原菌生长的影响 选用PDA、PSA、WA、OA、黑麦、蒲公英煎叶6种培养基。

菌丝生长测定：将分离纯化后得到的菌株在PDA培养基上培养7 d，在菌落边缘用直径为  5 mm的打孔器打取菌饼，分别将菌饼接到制备好的培养基中，每皿接种1块，置于25 ℃恒温培养箱中培养，7 d后用十字交叉法测量菌落直径，菌落直径减去菌饼直径5 mm则为菌落生长直径。每处理5次重复[11]。

产孢量测定：将分离纯化后得到的菌株在PDA培养基上培养7 d，在菌落边缘用直径为  5 mm的打孔器打取菌饼，分别将菌饼接到制备好的培养基中，每皿接种1块，置于25 ℃恒温培养箱中，培养7 d后用20 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板测出产孢量，每处理重复5次。培养基配方见表1。

1.3.2 碳源对病原菌生长的影响 以Czapek培养基[6]为基础培养基，用等量的葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、甘露醇代替其中的碳源，对照为不加碳源平板。数据测量方法同“1.3.1”。

1.3.3 氮源对病原菌生长的影响 以Czapek培养基[6]为基础培养基，分别用蛋白胨、甘氨酸、硫酸铵、牛肉浸膏等量替换察氏培养基中的氮源，对照为不加氮源平板。数据测量方法同“1.3.1”。

1.3.4 不同pH对菌落生长的影响 分别设置pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，7个梯度。数据测量方法同“1.3.1”。

1.3.5 不同温度对菌落生长的影响 以5 ℃为一个梯度，设置区间5 ℃～30 ℃内6种温度条件。数据测量方法同“1.3.1”。

2 结果与分析

2.1 田间症状与致病性测定

通过对甘肃省定西市渭源县等地的蒲公英叶片上的病害进行调查，蒲公英叶斑病典型症状为：叶片病害早期为针尖大小黄褐色斑点，后期病斑逐渐扩大，病斑内部颜色变浅，外部颜色变深为褐色，病灶内部凹陷，病斑大多为近圆形和椭圆形，病斑最外围有环状隆起。根据柯赫氏法则，采用菌饼接种和孢子悬浮液喷洒接种法，将分离出的病原菌接种于健康蒲公英叶片5  d后，出现的病斑与田间症状基本一致，重新分离出的病原菌与接种病原菌一致（图1）。

2.2 病原菌的形态特征

将保存的病原菌转接于制备好的PDA平板上，放入25 ℃恒温培养箱培养5 d，菌落初期为白色，随时间推移颜色逐渐变深呈墨绿色，气生菌丝白色，菌丝发达，菌落形状规则呈近圆形，边缘白色，后期有轮纹出现。镜检结果显示：病原菌菌丝为透明状，分生孢子梗分枝少，分生孢子顶生，呈长椭圆形或倒棒状，表面光滑，通常有1～6个横隔，0～3个纵膈膜，分隔处隘缩，顶端有短喙，孢子长18.3～47.6 μm、宽4.7～13.5 μm（图2）。

2.3 病原菌分子生物技术鉴定

用引物ITS、TEF1、rpb2对蒲公英叶斑病病原菌进行PCR扩增，并将产物送测后分别得到519 bp（ITS）、255 bp（TEF1）、960 bp（rpb2） 3条DNA片段。Blastn分析结果显示，菌株PHB与Alternaria tenmissima同源性为98%～99%（图3～5）。结合致病性与形态学特征，确定该病原菌为细极链格孢（Alternaria tenmissima）。

2.4 病原菌的生物学特性

2.4.1 培养基对病原菌生长的影响 细极链格孢在不同的培养基上，菌落生长速度有明显的差异。在PSA培养基上，细极链格孢菌落生长最快，平均菌落直径为52.05 mm，菌丝发达致密，菌落呈墨绿色，边缘整齐。相比之下，在蒲公英煎叶培养基和OA上，细极链格孢菌落的生长速度稍慢，平均直径较小，平均菌落直径分别为50.48 mm、51.69 mm，但仍然比其他培养基要大。在黑麦培养基上，细极链格孢菌落的生长情况最差。菌落呈灰绿色，直径在所有处理中最小，为23.82 mm。

除了生长速度和形态的差异外，细极链格孢在不同培养基上的产孢量也存在较大的差异。细极链格孢在PSA培养基上产孢量最大，可达  10.50×106mL-1。蒲公英煎叶培养基和OA产孢量次之，其他3种培养基上产孢量相对较少（图6）。

2.4.2 碳源对病原菌生长的影响 由图7可见，选取的供试碳源中，致病菌对葡萄糖的利用效果最好。经过7 d的培养后，观察到葡萄糖处理的平均菌落直径为79.36 mm，显著大于其他处理。此外，葡萄糖处理的菌丝浓密，菌落长势良好。最差的是甘露醇，其平均菌落直径仅为39.96 mm，显著低于其他碳源处理。

在供试碳源中，可溶性淀粉处理的产孢效果最好，达到了2.60×106 mL-1。其次是甘露醇和葡萄糖，它们的产孢效果稍逊于可溶性淀粉。蔗糖和乳糖的产孢效果较差。

2.4.3 氮源对病原菌生长的影响 由图8可见，试验选取的氮源对菌丝的生长均有一定程度的促进作用。其中，蛋白胨是5种氮源中促进菌丝生长效果最佳的一种。使用蛋白胨作为氮源时，菌落的长势良好，促进效果明显，菌落直径可达到72.82 mm。牛肉膏的促进效果稍弱，菌落直径为71.26 mm。甘氨酸和硝酸钠的促进效果次之，菌落直径分别为49.68 mm和48.99 mm。而以硫酸铵作为氮源的培养基，菌落的长势最差，菌落直径仅为26.27 mm。

蛋白胨和牛肉膏也对病原菌的产孢有着明显的促进作用。在使用蛋白胨和牛肉膏作为氮源时，病原菌的孢子数分别为2.77×106 mL-1和2.57×106 mL-1。而硝酸钠和甘氨酸的产孢效果较差，硫酸铵则完全不产孢。

2.4.4 pH对病原菌生长的影响 图9表明：一定程度上的pH波动对病原菌的生长影响不大，经过多次尝试之后发现，pH低于5时PDA的凝固效果较差，所以设置5、6、7、8、9、10、11，7个pH梯度。通过测定菌落直径发现，当pH为8时菌落长势最好，菌落直径为74.80 mm，当pH为5时，菌落长势最差，直径为50.31 mm；试验所选的pH中，病原菌在pH为8时产孢量最大，为  1.54×106  mL-1，其余处理之间差异不显著。

2.4.5 温度对病原菌生长的影响 试验证明细极链格孢在5～30 ℃的温度条件下均可以生长，其生长最适温度为20～30 ℃。在试验设置的6个温度梯度中，细极链格孢在25 ℃时长势最好，菌丝致密，菌落形状规则，菌落直径为45.20 mm，显著大于其他处理；试验设置的温度梯度中产孢最多的温度条件为30 ℃，孢子量为6.50×106 mL-1，其余随温度降低逐渐减少（图10）。

3 结论与讨论

本试验通过组织分离法，从蒲公英叶斑病病叶上分离出病原菌，通过柯赫氏法则验证、病原菌形态特征观察以及分子生物学鉴定，明确了其病原为细极链格孢（Alternaria tenuissima）。据报道Alternaria tenuissima可侵染蔬菜、水果、花卉等植物叶部，引起病害。如树莓细极链格孢叶斑病[12]、辣椒枯萎病[13]、三叶木通叶斑病[14]、大豆纹枯病[15]、黄芩叶斑病[16]、洋金花叶斑病[17]、番泻叶枯病[18]等均由细极链格孢引起，但目前尚未见针对蒲公英叶斑病分离鉴定的报道。在致病性试验中，该菌可在不刺伤供试叶片的情况下快速侵染叶片，说明其致病能力较强，侵染速度快。因此，对该病害应以预防为主，在病害初发期应迅速采取防治措施。由于蒲公英在甘肃省也作为主要的果园绿肥植物种植，所以对于该病原菌是否可以侵染果树及可侵染果树的种类仍需要进一步探究。

对病原菌生物学特性的深入研究，将有助于更好地理解该病害的发生机制，为其有效控制和预防提供科学依据。在本试验中，菌丝生长与产孢最佳的培养基为PSA，与袁蒲英等[19]的研究结果相似。本研究表明，病原菌的最适生长温度为20～30 ℃，pH为7.0～9.0时有利于病菌生长，这与6月份当地温度及土壤条件相符；本试验所选碳源中，病原菌利用效果最好的碳源是葡萄糖，产孢量最大的碳源为可溶性淀粉。而尚晓静等[12]的研究结果显示，细极链格孢的最适生长碳源为淀粉，产孢量最高的碳源为乳糖。其研究结果与本试验研究结果有一定区别，原因可能是由于寄主与地域环境的差异使细极链格孢的适生条件发生了一定变化；供试氮源中有机氮源蛋白胨最适宜病原菌的生长，而铵盐氮源培养的菌落长势较差，产孢量也较低，所以在生产中有机氮肥与铵态氮肥的灵活使用有可能降低蒲公英叶斑病发生概率。

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Pathogen  Identification and Biological Characteristics of Dandelion Leaf Spot Disease

ZHANG Ziqiang1，LI Jiping1，2，ZHENG Guo1，2，XU Binbin1，

ZHAI Yanqing1，HUI Nana2，WANG Li2 and MA Yanan1

（1.College of Plant Protection， Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China;

2.Institute of Plant Protection， Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070，China）

Abstract  To identify the pathogens and  investigate the biological characteristics of Taraxacum mongolicum  Hand  leaf spot disease in Weiyuan County， Dingxi City， Gansu Province，the pathogenic bacteria were isolated using tissue separation method. The morphological characteristics of the original bacteria were observed，and the pathogenicity was determined according to Kochs  postulates.The pathogenic bacteria were identified through  ITS，  TEF1 and  rpb2 gene sequence analysis.The results showed that Alternaria tenuissima was the pathogen of dandelion leaf spot， with optimal mycelium growth observed on PSA medium.The glucose was identified as the best carbon source for its growth， and preptone was the optimal organic nitrogen source.The pathogen exhibited optimal growth at a pH of 8 and a temperature of 25 ℃. This study elucidated the pathogenic bacteria   responsible for dandelion leaf spot and characterized their biological traits，providing a theoretical foundation for the future prevention and management strategies.

Key words Taraxacummongolicum  Hand;Leaf spot;Alternariatenuissima;Biological characteristics

Received  2023-09-14    Returned 2024-01-02

Foundation item National Natural Science Foundation of China（No.31560487）.

First author ZHANG Ziqiang，male， master   student.Research area：plant diseases and integrated prevention.E-mail：1430160731@qq.com

Corresponding   author LI Jiping，male，research fellow， master supervisor.Research area：plant diseases and integrated prevention. E-mail：gsljp@163.com

ZHENG Guo，male，research fellow， master supervisor.Research area：plant diseases and integrated prevention.E-mail：zhengguo@gsagr.ac.cn

（责任编辑：郭柏寿 Responsible editor：GUO Baishou）