基于海鲜调味料的肉类灌肠制品中副溶血性弧菌检测分析

王福红 李银塔 刘希凤

1.山东畜牧兽医职业学院 山东潍坊 261061 2.威海海洋职业学院 山东荣成 264300

副溶血性弧菌又称嗜盐弧菌，为革兰氏阴性杆菌，呈丝状、弧状、杆状等多种形状，无芽孢。副溶血性弧菌属于一种海洋细菌，主要存在于近海岸的海水、海底沉积物，以及鱼、虾、贝壳、蟹以及海藻等海产品中。在生产过程中，海产品由于杀菌不彻底、烹调加热不足等因素容易造成交叉污染，人们食用含有副溶血性弧菌的食物，从而导致食物中毒。

近年来，利用虾蟹壳为主要原料制备的海鲜调味料正越来越受到关注，虾蟹壳是水产工业加工的固体废弃物，将其加工成海鲜调味料，不仅减少生态环境污染，还可作为食品添加剂应用于肉类灌肠制品中，改善制品风味，满足不同群体的消费需求。然而海鲜调味料制备过程若卫生处理不当，会引起肉类灌肠制品中副溶血性弧菌污染[1]。据统计，副溶血性弧菌引起的食物中毒在中国细菌性食物中毒中位居第三，由此菌引发的卫生问题已引起食品行业的高度重视[2]。

通过对基于海鲜调味料的不同肉类灌肠制品中副溶血性弧菌进行定性和定量的检测分析[3]，以期为开发新型海鲜肉类灌肠制品，并控制其致病菌的污染，提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

3个生产批次、2种不同肉类灌肠制品(蟹味亲亲肠和虾味旺旺肠)共120份样品，均来自潍坊市中百大厨房肉制品有限公司。

1.1.2 试剂

氧化酶试剂、革兰氏染色液、ONPG试剂、V-P试剂，均购自北京陆桥技术股份有限公司；

3%Nacl溶液，由山东畜牧兽医职业学院实验室自行配置。

1.1.3 培养基

3%Nacl碱性蛋白胨水、TCBS琼脂平板、3%Nacl胰蛋白胨大豆琼脂平板、3%Nacl三糖铁琼脂斜面、3%Nacl甘露醇试验培养基、3%Nacl赖氨酸脱羧酶试验培养基、3%Nacl MR-VP培养基，均购于北京陆桥技术有限责任公司；

嗜盐性试验培养基(0%、6%、8%和10%不同Nacl浓度的胰胨水)，由山东畜牧兽医职业学院实验室自行配置。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

无菌操作，称取25g海鲜肉类灌肠制品，加入盛有225mL 3%Nacl碱性蛋白胨水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min。

1.2.2 增菌

1.2.2.1 定性检测

将制备的1∶10样品匀液于36±1℃培养8～18h。

1.2.2.2 定量检测

用无菌刻度吸管吸取1∶10样品匀液1mL，注入含有9mL 3%Nacl碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制成1∶100的样品匀液。另取一支1mL无菌刻度吸管，按上述操作程序，制成1∶1 000的样品匀液。在做10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别接种3管3%Nacl碱性蛋白胨水，每管接种1mL，并做好标记。置36±1℃恒温箱内，培养8～18h。

1.2.3 分离

对所有显示生长(变浑浊)的增菌液，用接种环沾取一环增菌液，于TCBS平板上划线分离，36±1℃培养18～24h。

1.2.4 纯培养

每个有可疑菌落生长的平板上挑取至少3个，分别划线接种3%Nacl胰蛋白胨大豆琼脂平板，36±1℃培养18～24h。

1.2.5 初步鉴定

1.2.5.1 氧化酶试验

用无菌细玻璃棒挑取新鲜纯培养的单个菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸上，10s内观察颜色变化。

1.2.5.2 涂片染色镜检

将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检，观察其形态及染色特性。

1.2.5.3 3%Nacl三糖铁试验

挑取纯培养的单个可疑菌落，接种3%Nacl三糖铁琼脂斜面，接种时先斜面划线后穿刺底层，36±1℃培养24h观察结果。

1.2.5.4 嗜盐性试验

挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0%、6%、8%和10%的不同Nacl浓度的胰胨水，36±1℃培养24h，观察液体混浊情况。

1.2.6 确定鉴定

1.2.6.1 3%Nacl甘露醇试验

取纯培养物接种含3%Nacl的甘露醇培养基，36±1℃培养24～48h后观察结果。

1.2.6.2 3%Nacl赖氨酸脱羧酶试验

取纯培养物接种含3%Nacl的赖氨酸脱羧酶培养基，36±1℃培养24～48h后观察结果。

1.2.6.3 3%Nacl V-P试验

取纯培养物接种含3%Nacl的MR-VP培养基，36±1℃培养24～48h后，向培养基中加V-P甲液和V-P乙液各2滴，轻轻摇动，观察结果。

1.2.6.4 ONPG试验

挑取3%Nacl三糖铁琼脂隔夜培养物1满环，接种于0.25mL 3%Nacl溶液，在通风橱中滴加1滴甲苯，摇匀后，置37℃水浴5min，加0.25mL ONPG溶液，36±1℃培养24h后观察结果。

2 结果

2.1 菌落形态

TCBS平板上可疑菌落呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2～3mm。

2.2 鉴定结果

2.2.1 氧化酶试验结果

滤纸在10s之内呈现粉红或紫红色，为阳性结果。

2.2.2 涂片染色镜检结果

革兰氏阴性菌，菌体呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，未见有芽孢。

2.2.3 3%Nacl三糖铁试验结果

培养基斜面颜色不变或红色加深，底层变黄不变黑，有动力，无气体产生。

2.2.4 嗜盐性试验结果

在6%Nacl和8%Nacl的胰胨水中生长旺盛，无Nacl和10%Nacl的胰胨水中微弱生长或不生长。

2.2.5 3%Nacl甘露醇试验结果

培养基变黄，为阳性结果。

2.2.6 3%Nacl赖氨酸脱羧酶试验结果

培养基紫色，为阳性结果。

2.2.7 3%Nacl V-P试验结果

培养基未呈现粉红，为阴性结果。

2.2.8 ONPG试验结果

溶液不变色，为阴性结果。

2.3 不同批次海鲜肉类灌肠制品中副溶血性弧菌定性、定量检测结果

副溶血性弧菌在TCBS平板上的可疑菌落呈圆形、半透明、表面光滑、绿色。副溶血性弧菌的生化性状见表1所示。

表1 副溶血性弧菌的生化性状

根据检出的可疑菌落生化性状进行结果报告，不同批次海鲜肉类灌肠制品中副溶血性弧菌定性、定量检测结果见表2所示。

从表2可知：蟹味亲亲肠有2个生产批次检出副溶血性弧菌各1株，虾味旺旺肠3个生产批次均未检出副溶血性弧菌，定性检测结果阳性样品占比为1.66%；第1个生产批次蟹味亲亲肠阳性样品中副溶血性弧菌MPN值是3MPN/g，第2个生产批次蟹味亲亲肠阳性样品中副溶血性弧菌MPN值是3.6MPN/g。

表2 不同批次海鲜肉类灌肠制品中副溶血性弧菌定性、定量检测结果

本次检测结果与试生产时的相比(2022年6月试生产的海鲜肉类灌肠制品中，蟹味亲亲肠和虾味旺旺肠共60份样品中，检出3株副溶血性弧菌，其检测方法与本次检测相同，参考GB 4789.7-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》)，阳性样品占比从5%下降为1.66%，阳性样品占比下降了3.34%。

3 讨论

(1)在3个生产批次的120份海鲜肉类灌肠制品中共分离出3株弧菌，经菌落形态观察、染色特性观察、生化试验等证实分离出的3株疑似弧菌有2株为副溶血性弧菌菌株；同时进行定量检测，其中1份蟹味亲亲肠阳性样品中副溶血性弧菌MPN值是3MPN/g，另1份阳性样品中副溶血性弧菌MPN值是3.6MPN/g。因本实验室检测条件有限，未对分离到的副溶血性弧菌菌株使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进一步鉴定。

(2)副溶血性弧菌又称嗜盐弧菌，是一种海洋性细菌，存在于海水和海产品中。蟹味亲亲肠由于生产过程中杀菌不彻底、烹调加热不足等造成交叉污染[4]，存在副溶血性弧菌菌株。本菌是致病性的菌株，可引起食物中毒。中毒症状以急性发病，腹痛、腹泻、呕吐等为主，亦有大便脓血，一般3～5d天痊愈，但重症者亦可造成脱水、休克。中毒的发生无年龄、种族的差异[1]。

(3)本次检测结果与前期试生产的海鲜肉类灌肠制品相比，阳性样品占比下降3.34%。这可能与正式投产后调整杀菌温度、时间及加强卫生管理有关。

本实验只对基于海鲜调味料的肉类灌肠制品中副溶血性弧菌进行了检验，基于海鲜调味料的肉类灌肠制品中是否存在其它致病菌，还有待进一步研究鉴定。