葡萄籽有效成分研究进展

林维晟,陈梦赐,解 田,苗志伟

(1.武夷学院生态与资源工程学院,福建 武夷山 354300;2.南开大学化学学院元素有机化学国家重点实验室,天津 300071;3.赤峰瑞阳化工有限公司,内蒙古 赤峰 024000)

葡萄是世界上产量和消费量最大的水果之一,具有庞大的产业链,在世界各地均有栽培和种植,主要分布在欧洲和北美洲。我国也具有丰富的葡萄资源,种植区域主要在新疆、河北和山东等地。近年来,我国葡萄的种植面积高达约70万hm2,年总产量达到1 200万～1 300万t,我国每年约有943万t葡萄用于鲜食,约9万t葡萄用于酿酒,剩下的做成果汁等其他产品,因而我国葡萄籽产量巨大[1]。葡萄籽是葡萄加工后产生的固体废弃物,通常的处理方式是将其作为农业肥料或动物饲料,或者进行焚烧处理[2],不仅造成焚烧过程中环境的污染,还会造成资源浪费。

研究发现,葡萄籽中含有亚油酸、原花青素、蛋白质、粗纤维、矿物质等成分,其中含有的药物活性物质具有抗氧化、抗衰老、降血脂、预防肿瘤和炎症、预防神经系统疾病和缓解辐射伤害等诸多功效,具有极高的营养价值,并且在保健品、化妆品、食品添加剂等方面具有广泛的应用。随着绿色生态和可持续发展环保理念的盛行,如何充分利用、合理开发葡萄籽资源,避免环境污染和资源浪费,延伸葡萄籽产业链,提高其附加值成为人们关注的重点。

1 葡萄籽有效成分

葡萄籽中主要含有的物质包括葡萄籽油、葡萄籽多酚和葡萄籽蛋白质。

1.1 葡萄籽油

葡萄籽油是葡萄籽经过压榨、脱水等工艺处理后得到的物质,具有独特的果香,营养丰富,是一种优质的可食用油脂。葡萄籽油在葡萄籽中含量占比约为10%～14%,主要含有的活性成分为不饱和脂肪酸、甾醇化合物、脂溶性维生素三大类,此外还含有多羟基芪氏化合物白藜芦醇以及18种以上氨基酸,同时含有K、Na、Ca、Fe、Zn、Mn等多种矿物元素[2]。

1.1.1不饱和脂肪酸

葡萄籽油含有的不饱和脂肪酸包括亚油酸、棕榈酸、硬脂酸和油酸,此外还含有微量的亚麻酸、月桂酸和肉豆蔻酸等物质,是评价葡萄籽油脂品质和营养价值的重要指标,具体的含量因葡萄的种类、提取技术和果实成熟度的不同而有所差异。

当前,气相色谱法或气相色谱-质谱法(GC-Ms)是检测分析葡萄籽油化学成分的主要方法。GC-Ms法结合了气相色谱法分离物质效率高和质谱法定性效果好的优势,具有灵敏度好、准确率高的优点,适用于检测沸点低于400 ℃的有机化合物[3]。Demirtast[4]采用气相色谱法对七种土耳其葡萄品种葡萄籽提取物进行含量检测,发现这几种葡萄籽中含有的脂肪酸分别为亚油酸含量为56.38%～68.56%、油酸含量为16.45%～29.48%、棕榈酸含量为8.19%～9.44%、硬脂酸含量为3.74%～4.98%。此外,Demirtast还在葡萄籽油中发现了花生醛酸、丙烯酸、棕榈油酸、肉豆蔻酸和庚烷酸。刘永衡[5]对黑比诺葡萄籽油进行GC-MS检测分析发现,黑比诺葡萄籽油含有5种酯类、5种脂肪酸和1种醛类化合物,其中,相对含量最高的是亚油酸(含量为55.36%),其次是亚油酸戊酯(含量为10.73%)、硬脂酸(含量为6.47%)。

总体而言,葡萄籽油中含有的脂肪酸和酯类化合物种类较多,并且每种脂肪酸在不同种类的葡萄籽中的含量有着较为明显的差异,但总体上葡萄籽脂肪酸最主要的成分是亚油酸和油酸。亚油酸是人体细胞生长所必须的营养物质,与油酸均具有降低血脂等功效,与其他种类的植物油相比,葡萄籽油中亚油酸含量更高。

1.1.2脂溶性维生素

葡萄籽油中含有维生素A、D、E、K等多种物质,其中维生素E的含量最高。维生素E是生育酚、生育三烯酚等能够显示D-α-生育酚生物活性物质的总称,分为α、β、γ、δ生育酚及其相应的生育三烯酚(见图1),一般具有良好的脂溶性、热稳定性和抗氧化性。人体自身不能合成维生素E,只能够从植物油中获得[6]。维生素E种类和结构见表1。

表1 维生素E种类和结构

图1 维生素E结构

检测维生素E的常用方法为液相色谱法。液相色谱法具有快速、分离度高、灵敏度高等优点,适用于高沸点、难挥发、稳定性差的有机化合物的检测与分析,尤其适用于植物提取物等复杂成分的快速分离分析。Demirtas[4]采用高效液相色谱法对葡萄籽油中生育酚的异构体——生育酚和生育三烯醇进行了测定,发现葡萄籽油中生育酚的主要形式为α-生育酚、α-生育三烯醇和α-生育三烯醇,含量分别为77.33～225.40 mg/kg、137.19～264.33 mg/kg和74.79～322.18 mg/kg。

1.1.3植物甾醇

植物甾醇主要存在于水果、蔬菜、豆类、坚果等植物中,是一种含环戊并全氢化菲骨架结构的化合物(见图2),由四个相并的环构成,此四个环分别标记编号为A环、B环、C环和D环,化合物结构上还含有三个侧链,分别标记编号为R1、R2和R3。R1和R2通常为甲基,有时也为醛基和羟基;在C3位通常带有一个羟基。β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇是最常见的植物甾醇。

图2 植物甾醇结构

当前检测植物甾醇的方法主要为气相色谱法或气质联用法(GC-Ms)。目前使用这两种方法检测不同品种葡萄籽中植物甾醇含量较高的植物甾醇品种,结果显示为β-谷甾醇、豆甾醇和油菜甾醇。Demirtas[4]将葡萄籽油样品经过甲酯化处理后,使用配备了氢火焰离子化检测仪(FID)的质谱仪检测总甾醇含量,结果显示在2 672～3 000 mg/kg之间,并检测到包括β-谷甾醇、豆甾醇、油菜甾醇、谷甾醇、Δ5-阿维他醇和Δ7-阿维他醇等在内的13种甾醇组分。Verdani品种葡萄籽中的β-谷甾醇含量最高,占总甾醇含量的71.62%,其他品种葡萄籽中β-谷甾醇含量占总甾醇含量的64.19%～70.14%。Harbeoui[8]将葡萄籽油提取后,经过三甲基硅醚化处理,利用GC-Ms进行分析发现,在Merlot、Syrah、Carignan三种葡萄籽中,β-谷甾醇含量最丰富,含量为3 285.92 mg/kg,其次是豆甾醇含量为297.71～535.35 mg/kg,油菜甾醇含量为165.22～303.64 mg/kg,胆固醇只在Merlot品种的葡萄籽中存在。这些研究成果表明,葡萄籽中含有丰富的植物甾醇品种,这也是葡萄籽具有降低胆固醇、抗氧化、抗炎抗菌、促进细胞生长等生物功能的物质基础。

1.2 植物多酚

多酚类物质广泛存在于各种植物中,是植物体内复杂的酚类次生代谢产物。葡萄籽多酚主要包括儿茶素类和原花青素类两种类型,儿茶素类葡萄籽多酚分为儿茶素、表儿茶素和没食子酸(见图3),是葡萄籽多酚中的单聚体。原花青素葡萄籽多酚[9]由多个不同的儿茶素类结构经过聚合作用形成,平均聚合度在2.4～16.7之间,分子结构末端以儿茶素结构为主,中间延伸链聚合单位以表儿茶素为主,其二聚体有8种结构形式(见图4),分别命名为B1-B8。原花青素含有多个羟基,具有较强极性,易被氧化或与金属离子发生络合,因聚合度和聚合结构的不同而表现出不同的化学性质和生物活性。

图3 儿茶素、表儿茶素和没食子酸结构

图4 原花青素二聚体结构

葡萄籽多酚的鉴定方法主要是使用液相色谱与质谱联用法(LC-Ms)。杨代晓[10]利用LC-Ms法对葡萄籽提取物中的多酚化合物进行测定,证实了葡萄籽提取物中多酚组分主要为没食子酸、儿茶素、表儿茶素三种单体酚和原花青素低聚体,其中,原花青素低聚体仅含二聚单酯和三聚单酯两种成酯型聚合体。未检测到4～5聚合度的成酯型聚合体,可以推测:随着聚合度的增加,原花青素成酯的难度也随之增加。

1.3 葡萄籽蛋白质和氨基酸

葡萄籽榨油脱酚后的饼粕中,蛋白质含量约为13%～16%,含有清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白等多种蛋白质,并且含有常见的天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸等17种氨基酸和酪氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸等人体所需的8种氨基酸,葡萄籽中氨基酸含量要高于大豆蛋白中的氨基酸含量,其中谷氨酸和天冬氨酸的含量较高[11]。将葡萄籽蛋白水解,可获得对人体有特殊生理功效且更易被人体吸收的小分子多肽。测定葡萄籽中蛋白质的方法有凯式定氮法、分光光度法、燃烧法、双缩脲法和Folin酚试剂法等方法。其中,凯氏定氮法是最主要的方法,其测定结果相对准确、重现性好、灵敏度高、干扰少,但是测定时间较长且试剂消耗量大[12]。

除上述有效成分以外,葡萄籽还含有角鲨烯、白藜芦醇、类胡萝卜素和多种矿物质。葡萄籽中具体的活性成分及其含量受到葡萄品种、种植的土壤环境和气候条件的影响,另外,提取方法的不同和检测仪器也会对检测结果造成一定影响。

2 葡萄籽有效成分的功效

2.1 抗氧化延缓衰老

人体新陈代谢过程中会生成能够引起人体脂质过氧化、生物膜损伤、胶原蛋白交联、产生细胞凋亡活性自由基,造成人体衰老和病变。人体衰老时,组织器官抵御疾病的能力减弱,人体内氧化和抗氧化能力失衡,又转而引起自由基堆积,进一步加速病变。Harbeouis[8]对Merlot、Syrah、Carignan三种葡萄提取物的萜类化合物、植物甾醇和生育酚进行了体外自由基清除实验,在达到清除一半自由基的效果时,三种葡萄籽油提取物作为抑制剂的浓度(IC50值)均低于2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)抗氧化剂,说明它们的抗氧化活性超过了BHT,其中Carignan葡萄籽油的抗自由基活性最高。上述研究成果说明,葡萄籽提取物中由于含有多酚、植物甾醇、维生素等多种天然抗氧话活性成分,可以帮助清除人体内过量自由基,从而具有维持体内氧化代谢平衡的效果,是一种天然的植物抗氧化药物。

2.2 降血脂改善肥胖

高脂血症是血液循环中以高甘油三酯或高胆固醇为特征的代谢疾病。葡萄籽提取物具有降低血脂、防止血栓生成、促进血液循环的效果,与降低心血管疾病风险密切相关。Cruz[13]给予大鼠高脂肪和高蔗糖饮食,同时给实验组的饮食加入原花青素,发现服用葡萄籽原花青素的大鼠能够有效降低体重、总脂肪含量和肝脂肪变性程度,改善高热量饮食引起的代谢混乱。Mokhtar[14]发现在高胆固醇饲料中添加葡萄籽提取物(GSO),能够显著降低大鼠血清中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TRIG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和极低密度脂蛋白(VLDL)水平,并显著提高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平,提高血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)含量,以提高肝功能水平,同时能够降低血清中丙二醛(MDA)含量,提高血清中胱甘肽S-转移酶(GST)含量,使大鼠的心脏和主动脉功能增强。表2描述了分别服用基础饮食和高胆固醇饮食8周后大鼠生理指标的结果,以及服用了加入4%葡萄籽提取物的基础饮食、服用了分别加入2%和4%葡萄籽提取物的高胆固醇饮食8周后大鼠生理指标的结果。

由于葡萄籽提取物中含有较多游离脂肪酸,如亚油酸等具有参与刺激人体细胞生长、调节血脂成分、提高抗氧化活性成分含量的功能,因此能够降低高热量饮食导致的肥胖程度,并促进生物体脂肪消耗和热量代谢,调节生物体胆固醇、相关蛋白和酶水平的能力,从而达到增强生物体心血管功能的效果。

2.3 抗癌症和肿瘤疾病

癌症和肿瘤是危害人体健康的恶性疾病之一,而葡萄籽提取物的活性成分能够通过调节肿瘤细胞及其下游靶点,有效作用于人体内细胞相关信号通路的表达,实现抑制癌细胞增殖的效果。例如,张丽明[15]通过网络药理学的方法,预测了葡萄籽油抗癌和抗肿瘤作用的关键靶点是信号转导子和转录激活子(STAT3)、丝裂原激活蛋白激酶1(MAPK1)等与肿瘤产生密切相关的生物酶,这些关键靶点通过调节酶结合等生物学功能,参与大肠癌、胰腺癌等癌症通路的调控来治疗癌症和肿瘤。Mao[16]首次研究证实葡萄籽原花青素提取物能够显著降低肺部肿瘤细胞中miR-19a和miR-19b的表达,增加胰岛素生长因子Ⅱ受体(IGF-2R)、磷酸酶和紧张蛋白同源物(PTEN)的mRNA和蛋白水平。此外,花青素提取物显著增加了A549细胞中的PTEN活性,降低了肺部致癌因子AKT的磷酸化程度。

2.4 抗炎症

全球死亡率的增加与慢性疾病的发展有关,各种慢性疾病通常伴随着炎症的发生,摄入具有抗炎功能的营养物质将有利于治疗慢性疾病。葡萄籽具有良好的抗炎活性,这主要与其含有不饱和脂肪酸、维生素E、酚类物质和甾醇类相关。Tanideh[17]等人经过实验研究表明,在关节内注射或者口服葡萄籽油对骨关节炎有良好的治疗效果,用葡萄籽油进行治疗的小鼠关节表面、基质、细胞分布、细胞群活力、软骨钙化和软骨下骨的病理评估均优于对照组。

2.5 改善神经疾病

老年痴呆和帕金森综合症均为神经退行性疾病,以老年人患病居多。老年痴呆表现为认知能力下降、记忆丧失和日常行动能力下降。帕金森综合症在病理上表现为脑神经炎斑块和神经纤维缠结导致神经突触的结构和功能受损,Tau蛋白进行沉积、神经元被破坏而最终导致病症。葡萄籽提取物则可作为一种能够有效改善老年痴呆和帕金森等神经退行性疾病的神经保护剂,因葡萄籽中含有大量酚类化合物等抗氧化活性成分,而对多巴胺能神经元的存活产生积极影响,并缓解因氧化应激引起的阿尔兹海默症,能够有效预防老年痴呆。

Youssef[18]使用能够诱导氧化损伤的神经毒素6-羟多巴胺(6-OHDA)对小鼠中脑多巴胺能细胞进行处理,模拟帕金森病中多巴胺能神经元的退化,证实原花青素通过抑制炎症发生、减少活性氧(ROS)水平和减少细胞凋亡,能够有效保护多巴胺能神经元免受6-OHDA的毒害,提高细胞多巴胺能神经元的存活率。Berahmand[19]经实验证实,向大鼠注射葡萄籽提取物可显著提高大鼠的空间记忆能力、乙酰胆碱水平和细胞活力,且治疗效果与胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐相当。

2.6 缓解辐射损伤

辐射能够导致人体内生物分子的化学键发生断裂,引起人体DNA分子损伤和蛋白质的破坏,进而引起体内组织细胞的突变,引发人体组织和器官的损伤,造成代谢等功能紊乱,对人体健康造成巨大伤害。而葡萄籽提取物中的有效成分能够通过帮助清除生命体内因受辐射而产生的过多自由基,并调节相关酶的水平等来缓解辐射对生命体造成的损伤,提高受伤细胞的活力。Ismail[20]发现口服CCl4并经γ射线辐射会对大鼠造成神经系统损伤等危害,但是口服葡萄籽油能提高大鼠体内抗氧化酶的活力,下调黄嘌呤氧化酶(XO)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)等基因的表达,对大鼠神经起到保护作用。Yarovaya[21]经过实验发现,在0.10～31.25 μg/mL范围内,葡萄籽提取物能呈剂量依赖性地显著增加成纤维细胞活力,活力值最高可达132%。经过25 μg/mL浓度葡萄籽提取物处理成纤维细胞后,可使细胞存活率提高68%。

3 葡萄籽的开发和应用

葡萄籽营养价值高,对人体无毒副作用,不仅可以提取葡萄籽油作为食用油,而且可以开发成食品添加剂、保健品、化妆品等功能性产品,另外在生物油料、医用高分子材料领域也具有极高的利用价值。

3.1 作为牲畜及水产养殖饲料

葡萄籽中含有蛋白质、脂肪和多种无机元素等营养物质,是良好的动物饲料,同时葡萄籽成本低廉,加工处理方便,能够作为补充成分用于添加至牲畜、家禽和水产生物饲料中的添加剂,可以调节生物体内生理代谢平衡,从而改善动物的生长状况,有效促进畜牧业和养殖业的发展。Farahat等[22]将葡萄籽提取物作为肉鸡饲料补充剂,与用添加丁基羟基甲苯抗氧化剂饲料喂养的肉鸡相比,经过添加该饲料补充剂喂养的肉鸡,其生长情况、存活率、总脂质和高密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇含量均优于前者,同时能够使肉鸡体内胆固醇密度降低、病毒抗体含量增加。Arslan等[23]研究发现,在饲料中添加1 000 mg/kg葡萄籽油能够显著提高虹鳟体内的抗氧化酶活性,并提高幼鱼的存活率和脂肪含量,使其更加健康。

3.2 作为保健食品

葡萄籽油营养价值全面,具有特殊果香,在高温烹饪过程中也不产生油烟和有害物质,可作为传统食用油的替代品。李哲[24]将葡萄籽和亚麻籽油按照5∶95的比率制成调和油,改变了单一植物油营养和口味单调的弊端。葡萄籽中蛋白质因其特殊的性质被用来制成蛋白质饮品,邹圣东[25]发明葡萄籽蛋白饮料,拥有蛋白饮料和果仁特有的醇香,口感细腻。这些应用表明,葡萄籽被应用于多种食品中,不仅有效地改善了食物的风味,还能够增加产品的营养成分,促进人体的健康。

3.3 作为食品添加剂

向蛋糕、酸奶、面粉和肉制品等食品中加入葡萄籽提取物可以改善食物的风味、口感和质地,同时葡萄籽提取物中因含有大量抗氧化活性成分并具有显著的抗菌性能,加入食品中可以延缓食品变质、抑制细菌滋生,延长食品的保质期。解春艳[26]将葡萄籽蛋白作为膨松剂用于制作蛋糕,可以中和鸡蛋的蛋腥味,同时使营养更加丰富、风味更加独特。Varedesara[27]在酸奶中添加葡萄籽蛋白质水解物,提高了酸奶的pH值和黏稠度,使干酪乳杆菌活力增强,让酸奶具有更好的口感。Chen等[28]向小麦面粉中加入少量的葡萄籽粉,能够提高面条的口感和劲道程度。Zhou等[29]经过研究发现,在西式烟熏香肠中加入葡萄籽提取物,能够降低香肠的咀嚼性,并可显著降低香肠内的防腐剂亚硝酸盐含量。Xiong等[30]研究发现,在1%壳聚糖与3%明胶体系中加入0.5%的葡萄籽提取物,能够进一步提高猪肉抗菌和抗氧化作用,延长冷藏保鲜时间。

3.4 作为化妆美容产品

葡萄籽油油质轻薄、易于吸收、安全无刺激,可用于制作口红、润肤霜和按摩油,其抗氧化性有助于延缓皮肤的衰老,是天然的护肤剂。林童[31]将葡萄籽油制作成可食用性口红,其稠度和延展性等和市售口红无显著差异。周晓微[32]以葡萄籽为原料制备防晒霜,能够有效缓解紫外线照射引起的皮肤老化。曹燕亚[33]用藏红花、苏木、枸杞、何首乌和葡萄籽油为原料制备按摩油,该按摩油具有良好的保湿效果,能够提高皮肤弹性,具有一定的抗衰老作用。李雪峰[34]在香波里添加葡萄籽油,使得洗发香波具有更强的保湿性和抗氧化活性。这些新型化妆品的开发不仅丰富了葡萄籽油的应用领域,而且为化妆品升级换代提供了有效保证。

3.5 用于制作功能性薄膜

葡萄籽提取物可用于制作食品包装,与传统包装相比,加入葡萄籽提取物的可食用薄膜涂层能够直接接触食品表面,同时提升了薄膜的亲水性、渗透性、弹性、抗菌抗病毒等相关性能,增大了包装薄膜的适用范围。Marudova[35]研制了由羟丙基甲基纤维素和葡萄籽油制备而成的新型生物基多组分可食用性膜,葡萄籽油的加入增加了薄膜的亲水性,提高了水蒸汽的渗透性,降低了薄膜的吸湿率,提升了薄膜变形、发生断裂的上限,使其更富有韧性,此薄膜可作为水果的可食用涂层使用。Roy[36]将氧化锌纳米棒和葡萄籽提取物用于纤维素纳米纤维复合薄膜的制备,葡萄籽提取物的添加能够改善抗紫外线和蒸汽阻隔性能,增加薄膜抗菌和抗氧化能力。Fabra[37]在海藻酸盐薄膜中添加葡萄籽提取物作为活性剂,使薄膜具备抗小鼠诺如病毒和甲型肝炎病毒的生物活性。

3.6 作为新型燃料油

近年来,石油和煤炭等不可再生能源的使用成本逐渐增加,在旧能源终将枯竭的危机意识下,寻找新型能源成为全球不可阻挡的趋势。葡萄籽油作为从植物中提取的油脂受到新型燃料油领域的广泛关注。Sridhar[38]研究发现,在柴油和葡萄籽油中分别混合20 mg/L浓度的氧化铝添加剂后,两者的制动热效率几乎相同,并且在同样都与20 mg/L浓度氧化铈混合的情况下,相比于柴油,葡萄籽油一氧化碳的排放量明显减少,但是氮氧化物排放量高于柴油。因此,葡萄籽油和柴油都具有彼此的优劣势,在柴油不可再生的特性下,拥有较好制动热效率的同时又可再生的葡萄籽油,具有更大的环境保护意义,增加对葡萄籽油的开发和使用,将有助于节约资源、促进绿色环保。

3.7 用于制备医用材料

葡萄籽提取物还被应用于医用材料领域,例如被用于制作止血气凝胶和骨组织再生支架,能够对人体伤口治愈和组织的再生起到良好的促进效果,同时还可以被添加至抗肿瘤药物中提高治疗效果。Figueroa等[39]以氧化石墨烯和壳聚糖为原料制备了止血气凝胶,添加葡萄籽提取物后,可提高气凝胶的粗糙度和硬度。Chao等[40]利用葡萄籽油、蜂蜜和蜂胶制作模拟骨骼天然结构的支架,可用于骨组织再生。该支架具有热稳定性高、表面粗糙度低、对人体细胞无毒且与血液能更好相容等特点。Lacatusu等[41]以葡萄籽油和月桂叶油为原料制备了脂质纳米载体,具有较好的氧自由基清除作用,能破坏肿瘤细胞,显著提高抗肿瘤药物在临床应用中的疗效。

4 葡萄籽油和葡萄籽有效成分的提取方法

目前,葡萄籽油和其他有效成分的提取方法主要有机械压榨法、溶剂浸提法、超临界二氧化碳萃取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法和水酶法。其中,葡萄籽蛋白质的主要提取方法是碱溶酸沉法、盐析法、酸热法和酶解法。不同提取方法对葡萄籽提取物活性成分的品质和作用效果具有不同影响。

4.1 机械压榨法

机械压榨法分为冷榨法和热榨法,主要用于获取葡萄籽油。冷榨法在工艺流程中不易引起天然产物的分解,使得到的油脂较为纯正,但是该方法需要在前期涉及除杂、粉碎、软化、压榨、过滤等多步处理工艺,耗能大且出油率低。相比而言,热榨法出油率更高,但是营养物质经过高温处理之后损失较大[42]。

Juhaimi[43]用冷榨法获取葡萄籽油,得到亚油酸的含量占所有提取成分质量的比例为59.61%～72.13%,α-生育三烯醇含量为13.21～34.71 mg/100g,儿茶素含量为427.80～847.14 mg/kg。任继波[42]利用液压热榨法制备葡萄籽油,单批投料量为40 kg、压榨压力为40 MPa、物料粉碎度为60目,炸膛温度为50 ℃条件下,压榨60 min,蒸料40 min,葡萄籽出油率为12.2%,达到最高。对葡萄籽出油率的影响因素从大到小依次是物料粉碎度、炸膛温度和蒸料时间。

4.2 溶剂浸提法

传统溶剂浸提法使用索氏提取装置和有机溶剂进行葡萄籽有效成分提取,该方法提取率高且不破坏天然产物的结构,但是可能会造成有机溶剂的残留难以除去,使用深层共晶溶剂提取则能够提高该方法的绿色环保性。Dabetic[44]用含柠檬酸或葡萄糖的氯化胆碱深层共晶溶剂提取葡萄籽多酚,该方法的提取效率高,所得提取物的抗氧化活性优于用酸化醇水溶液作为溶剂进行提取的方法。

4.3 酶解法

酶解法利用特定酶分解植物细胞与组织,加速细胞中成分的释放并溶解到溶剂中。此方法条件温和、安全无毒、工艺步骤少、节约成本,提取效率高。马波[45]使用多粘类芽孢杆菌液体发酵技术得到富含果胶酶的发酵液,酶解葡萄籽后提取原花青素,粘类芽孢杆菌发酵液酶活性为313 U/mL,料液比为30 g/L,在pH值为9、温度为45 ℃的条件下,提取70 min,可得0.033 9 mg/(1 000 mg原料)原花青素提取率,提取率远大于单用水浸提的0.64%。李丹丹[46]用纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和胰蛋白酶以2∶1∶2∶1比例配制而成的复合酶,在体系pH值为6.5条件下,按照1∶9的料液比酶解葡萄籽9 h,得到葡萄籽油的最佳提取量为99.47 mg/g,蛋白质最佳提取量为74.86 mg/g,蛋白质提取量影响因素按从大到小依次是pH值、料液比、酶配比和酶解时间。

4.4 超临界二氧化碳萃取法

该方法利用超临界二氧化碳溶解萃取物,再通过调节压力或者温度等条件使活性组分析出达到分离目的。二氧化碳具有惰性无毒、传递性质好、非极性亲脂等特点,该法提取条件温和、安全环保、提取效率高,可回收溶剂。Duba[47]经过实验发现,在恒温条件下,葡萄籽油在超临界二氧化碳中的溶解度随压力的增加而增加。在不同压力条件下,溶解度随温度的变化情况则不同,在20 MPa压力条件下时,溶解度随着温度的升高而降低,在大于35 MPa的高压条件下,溶解度随温度的增加而增加。Porto[48]采用两步提取法,先用超临界二氧化碳去除葡萄籽中的非极性成分,再向超临界二氧化碳中加入共溶剂,从葡萄籽中回收多酚,经过研究发现,在8 MPa压力下,当二氧化碳流量为6 kg/h,且加入20%的乙醇-水混合物作共溶剂,100 g葡萄籽原料中能得到7 132 mg总多酚。

4.5 超声辅助提取法

超声辅助提取法的工作原理是基于空化现象,在超声处理中,因负压产生气泡,导致压力和温度升高,气泡在靠近固体表面附近时发生破裂坍塌,由此产生的“冲击波”会破坏细胞壁,有利于溶剂渗透到植物材料中,并允许生物活性化合物的释放、增强细胞膜的传质,具有操作简便快捷、提取率高、不破坏有效成分的优点[49]。尹佳[50]通过响应面法优化提取工艺,得出当原料葡萄籽和溶剂乙醇混合时的固液比为1 g∶12.42 mL时,在超声频率为81.42 kHz和温度为33 ℃条件下,超声提取73.97 min为最优工艺条件,此时葡萄籽油脂的得率为20.26%。Vural[49]发现在溶剂乙醇浓度为61.76%、原料葡萄籽和溶剂乙醇溶液混合时的固液比为1 g∶30 mL,萃取温度为50 ℃条件下,萃取20 min为最佳条件,可得到总酚25.96 ± 0.70 mg/g,抗氧化活性成分93.78% ± 0.42 g。温度是影响多酚提取速率的关键因素,提升温度可以降低物质的表面张力和黏度,提高多酚的扩散系数和溶解度,但超过50 ℃酚类物质会因变性而影响提取率。

4.6 微波辅助提取法

微波辅助提取法利用高频电磁波使植物细胞破裂,并使有效物质在电磁场作用下加速扩散,具有环保、产物纯度高、萃取时间短和溶剂选择性高的特点。Chen[51]优化微波辅助提取法后的条件用浓度为94%乙醇为溶剂,在170 ℃下微波振荡55 min,与不经过微波辅助处理相比,提取的单体儿茶素增加3.9倍,原花青增加5.5倍,且该法提取物比常规方法提取物具有更高的抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性。

4.7 碱溶酸沉法

碱溶酸沉法是一种利用混合物中各组分酸碱性差异而进行分离提取的方法,常用于提取蛋白质成分。吴芳[52]用响应面法优化蛋白质提取工艺,发现温度对提取率的影响最大,随着体系内pH值的升高,蛋白质沉淀量呈先增加后减少的趋势,即在溶液中的残留率先减少后增加;在45 ℃、料液比1∶25(g/mL)条件下,用0.001 mol/L的NaOH溶液浸提40 min后,将溶液pH值调成3.8时,得到的蛋白质沉淀物最多,蛋白质最高提取量为9.75 mg/g(见图5)。

图5 溶液中蛋白质的残留率随溶液pH值变化的情况

4.8 酸热法

酸热法是首先通过盐酸浸泡破坏植物的细胞壁,然后利用有机溶剂对活性成分进行提取的方法。吕慧威[53]经洗净、烘干、粉碎、盐酸浸泡、加石油醚振荡、萃取、干燥、浓缩等步骤提取出纯度较高的葡萄籽油,随着酸度的增加,提油率先增加后降低,在盐酸浓度为4.09 mol/L时提油率达到最大。提取最佳条件为料液比1∶6,酸热时间59.37 min,酸热温度75.85 ℃,提油率为26%。

4.9 盐析法

蛋白质在水中的溶解度由蛋白质分子上的亲水基团与水形成水化膜的程度,以及蛋白质分子带电荷的情况这两种因素决定。中性盐加入蛋白质溶液后,盐对水的亲和力大于蛋白质,从而使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失,同时盐中和了蛋白质表面电荷,使蛋白质在水中的溶解度降低,从而使蛋白质析出。盐析法即是利用上述原理获得蛋白质。温小娟[54]研究发现,在葡萄籽粒粉碎粒度为60目、料液比为1∶20,提取温度为40 ℃条件下,用浓度为1.0 mol/L的NaCl溶液浸提葡萄籽40 min乌海产葡萄籽样品和银川产葡萄籽样品的蛋白质,提取率分别为64.46%和49.42%,影响样品蛋白浸提量的因素为温度、NaCl浓度、料液比和浸提时间。

上述各种提取方法均可以实现葡萄籽油和葡萄籽有效成分的提取和分离,其中,溶剂提取法多采用甲醇、乙醇、丙酮等极性较大的溶剂,提取时间较长,效率较低,而且会有有机溶剂残留,造成对产品的污染。超声、微波、超临界二氧化碳萃取等新技术提高了提取效率,而且无溶剂残留,活性成分和热不稳定成分不容易被破坏,但是超临界提取所需设备价格昂贵,生产成本高,目前还难以实现大规模工业化生产。再比如碱溶酸沉法、酸热法、盐析法等提取方法,同样存在操作步骤繁琐、提取效率不稳定等需要解决的实际问题,为此仍需研究开发更加高效和稳定的葡萄籽油和葡萄籽有效成分提取方法。

5 总结与展望

随着我国葡萄产业的日益发展和壮大,生产中必定会产生大量的葡萄籽。葡萄籽中的营养成分包含不饱和脂肪酸、植物甾醇、维生素、原花青素等植物多酚,及具有特殊生物活性的葡萄籽蛋白质,且具有抗氧化、抗衰老、降血脂、预防肿瘤和炎症、预防神经系统疾病、缓解辐射损伤等药理功效,可广泛应用于食品、保健药品、美容化妆类产品、食品添加剂等领域。未来,围绕葡萄籽的综合利用将从以下3方面开展工作:①发展高效提取分离技术,进一步提高葡萄籽有效成分的提取率;②加大对葡萄籽有效成分生物活性和药用功能研究,扩大葡萄籽有效成分应用领域;③创新葡萄籽有效成分加工技术,提高产品附加值生产高端葡萄籽下游产品。未来随着针对葡萄籽有效成分研究工作的不断深入,我国葡萄产业发展一定会更加兴旺发达。