SPK、S1P蛋白在骨肉瘤中的表达及其临床意义

张 武,王守朋,张兆川,褚宏章,王绍伟

(山东国欣颐养集团枣庄医院 骨科,山东 枣庄 277100)

骨肉瘤为原发性恶性骨肿瘤,多发于儿童与青少年人群,以疼痛、肿胀、病理性骨折为主要临床表现,由于其恶性程度高,侵袭性强,预后较差,病人术后5年生存率为65%～75%,骨肉瘤易发生转移,以肺转移为常见,发生转移病人的5年生存率仅为20%,目前关于骨肉瘤的发病机制尚不十分清楚[1-2]。鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SPK1)是鞘脂代谢平衡的重要限速酶,可催化神经酰胺磷酸化形成1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P),SPK1具有癌基因特性,在肿瘤中高表达,并促进肿瘤恶性转化[3]。吕冰洁等[4]研究表明,SPK1在小鼠肺癌细胞中高表达,抑制SPK1表达可通过Bcl-2/Bax途径干扰肺癌细胞凋亡。SPK1与S1P形成SPK1/S1P通路,在调控肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移及耐药性等过程中发挥重要作用[5]。目前SPK1、S1P在骨肉瘤组织中的研究尚未见报道。本研究通过检测骨肉瘤组织中SPK1与S1P的表达情况,探讨其与骨肉瘤发生发展的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年7月至2018年8月我院收治的73例骨肉瘤病人作为研究对象,手术取骨肉瘤组织,所选病人中男45例,女28例,年龄7～45岁。73例病人中,肿瘤直径<5 cm者31例,≥5 cm者43例;发病部位为肢体55例,躯干部18例;骨母细胞型35例,软骨母细胞型18例,纤维骨母细胞型20例;Eneeking分期Ⅰ期者29例,Ⅱ～Ⅲ期44例;有肺转移者33例,无肺移者40例。纳入标准:(1)经病理学检查确诊为骨肉瘤;(2)术前未行靶向治疗、放化疗或免疫治疗;(3)病人临床资料完整。排除合并其他恶性肿瘤病人。

选择同期医院进行手术的骨软骨瘤手术切除标本31例作为对照,其中男18例,女13例,年龄8～46岁。本研究样本采集均经过本院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

SP免疫组化试剂盒及配套试剂、辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)标记山羊抗兔IgG购自北京索莱宝科技有限公司,兔抗人SPK1、S1P多克隆抗体购自Abcam公司。

1.3 免疫组织化学染色

手术过程中取得的骨肉瘤组织与软骨瘤组织标本石蜡包埋,连续切片(约4 μm厚)后,使用二甲苯脱蜡,浸入EDTA溶液中微波抗原修复10 min,去离子水洗涤,使用3% H2O2溶液以灭活内源性过氧化物酶,加入兔抗人SPK1(1∶800)、S1P(1∶1 000)多克隆抗体,4 ℃冰箱孵育过夜后,PBS洗涤,加入HRP标记的IgG(按1∶1 000稀释),室温孵育1 h,PBS洗涤,DAB染色,苏木素复染,梯度乙醇脱水,中性树胶封片,用已知阳性骨肉瘤组织切片做阳性对照,PBS为一抗作为阴性对照,显微镜观察。

染色结果判断:SPK1、S1P阳性表现为棕色或黄色颗粒,主要定位于细胞质或细胞膜。

评分=染色强度评分×阳性细胞比例评分,阴性(-)0分,弱阳性1～4分,记为(+),阳性为5～8分,记为2+,强阳性为9～12分,记为3+。 细胞染色强度评分:无着色评0分、淡黄色评1分,棕黄色评2分,棕褐色评3分;阳性细胞比例评分:阳性细胞比例为0～5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%,分别评分为0、1、2、3、4分。

1.4 统计学方法

采用χ2检验和Kaplan-Meier生存曲线。

2 结果

2.1 骨肉瘤组织与软骨瘤组织中SPK1及S1P表达水平比较

免疫组织化学染色结果显示,SPK1、S1P主要定位于细胞膜或细胞质,骨肉瘤组织SPK1阳性表达率为68.49%,高于软骨瘤组织中阳性表达率16.13%;骨肉瘤组织S1P阳性表达率为58.90%,高于软骨瘤组织中阳性表达率22.58%,差异均有统计学意义(P<0.01)(见表1、图1、2)。

表1 骨肉瘤组织与软骨瘤组织中SPK1及S1P表达水平比较[n;百分率(%)]

2.2 SPK1、S1P与骨肉瘤临床病理特征的关系

根据SPK1、S1P在骨肉瘤组织中表达阳性结果,将骨肉瘤病人分为SPK1阳性表达组50例和S1P阴性表达组23例,S1P阳性表达组43例和S1P阴性表达组30例。分析发现,SPK1、S1P在Eneeking分期为Ⅱ～Ⅲ期和肺转移的病人中阳性表达率较高,差异均有统计学意义(P<0.05～P<0.01);SPK1、S1P在病人不同性别、年龄、肿瘤直径、发病部位、病理类型的阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 SPK1、S1P与骨肉瘤临床病理特征的关系[n;百分率(%)]

2.3 SPK1和S1P表达与骨肉瘤病人生存率关系的Kaplan-Meier生存分析

73例病人全部完成随访,27例因死亡而终止随访,通过Kaplan-Meier生存曲线分析可知,SPK1阳性表达病人3年生存率为38.50%,SPK1阴性表达病人3年生存率为74.17%,SPK1阳性表达组3年生存率低于SPK1阴性表达组(χ2=5.63,P<0.05);S1P阳性表达病人3年生存率为34.06%,S1P阴性表达病人3年生存率为77.44%,S1P阳性表达组3年生存率低于S1P阴性表达组(χ2=8.95,P<0.05)(见图3)。

3 讨论

骨肉瘤是一种恶性程度及自残率极高的原发性肿瘤,其起病较为隐匿,早期发现比较困难,但进展快,多数病人确诊时已到中晚期,10%～20%的病人确诊时发生灶转移,导致病人预后较差,5年生存率较低,因此研究骨肉瘤的发病机制,对骨肉瘤的早期诊断及治疗具有重要临床意义[6-7]。

细胞内鞘磷脂代谢如SPK1、S1P与细胞增殖、凋亡密切相关,在肿瘤的发生中发挥重要作用,SPKl是一种具有广泛作用的细胞因子,对内皮细胞、软骨细胞、肿瘤细胞等多种细胞具有调节作用,与细胞的凋亡、增殖和迁移密切相关[8-9]。既往研究表明,SPK1在胃癌、结肠癌、鼻咽癌、肝癌、白血病等多种肿瘤中均有研究[10-11]。研究[12]显示,SPK1在骨肉瘤细胞中上调表达,与阿霉素耐药有关,敲低或过表达SPK1可改变阿霉素耐药性和细胞增殖活性。本研究结果显示,骨肉瘤组织SPK1阳性表达率显著高于软骨瘤组织中阳性表达率,提示SPK1可能与骨肉瘤的发生有关。通过分析SPK1与骨肉瘤临床病理特征相关性显示,SPK1在Eneeking分期为Ⅱ～Ⅲ期和肺转移的病人中阳性表达率较高,提示SPK1表达水平与骨肉瘤进展有关,与以往研究结果类似。蔡笃雄等[13]研究表明,胰腺癌中SPK1表达水平升高,SPK1的激活可促进胰腺癌细胞的增殖并抑制细胞的凋亡。推测SPK1可能通过促进骨肉瘤细胞增殖与转移,进而促进骨肉瘤的发生发展。进一步分析发现,SPK1阳性表达组3年生存率低于SPK1阴性表达组病人,提示SPK1可能与骨肉瘤病人生存情况有关,提示SPK1可能作为评估骨肉瘤病人预后的生物标志物。

SPK1是细胞内合成S1P的主要限速酶,S1P是一种抗凋亡基因,可促进细胞增殖,S1P与其受体S1PR结合,在调控肿瘤细胞的增殖、迁移等过程中发挥重要作用[14]。宋娟等[15]研究表明,乳腺癌细胞中S1P激活可通过调节STAT3信号通路促进乳腺癌细胞增殖。而抑制S1P及其受体信号通路,可抑制肺腺癌细胞的迁移与侵袭[16]。本研究结果显示,与软骨瘤组织比较,S1P在骨肉瘤组织中阳性表达率显著升高,提示S1P与骨肉瘤的发生发展过程有关。进一步分析结果显示,骨肉瘤组织中S1P表达水平与Eneeking分期和肺转移有关,提示S1P表达水平与骨肉瘤疾病进展有关。另外,本研究还显示,S1P阳性表达组3年生存率低于S1P阴性表达组,提示S1P阳性表达病人可能生存率较低,与病人预后相关。

综上所述,SPK1、S1P蛋白在骨肉瘤组织中高表达,且与骨肉瘤病人临床病理特征和预后有关,可能作为骨肉瘤病人潜在的预后标志物。但由于本研究临床样本数据少,可能存在一定偏倚,将扩大样本量作进一步研究。