β-受体激动剂类药物人工抗原合成方法研究进展

孙晓亮，王晓茵，方汉卿，宋翠平，赵思俊，曹旭敏，李木子

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

β-受体激动剂是一类化学合成的具有苯乙醇胺结构的药物，可促进蛋白同化，提高瘦肉率，个别不法分子将其用于畜禽养殖，以达到非法牟利的目的。长期或大剂量使用β-受体激动剂类药物能引发畜禽生理系统中毒，导致心脏颤动、心动过速、神经过敏、肌肉颤动、意识模糊，甚至中毒[1-4]。因此，包括我国在内的许多国家都禁止克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等β-受体激动剂用于食品动物养殖。

为了加强β-受体激动剂类药物的残留监管，国内外学者对该类药物的检测方法开展了广泛而深入的研究。目前对β-受体激动剂类药物进行残留检测的方法有液相色谱法[5]、液相色谱-串联质谱法[6]、气相色谱-串联质谱法[7]等定量确证检测方法，以及酶联免疫吸附测定法[8]、胶体金试纸法[9]等免疫快速检测方法。其中，免疫分析方法主要基于抗原抗体的特异性反应，具有操作简便快速、灵敏度高、检测成本低等优点，已被广泛应用于大批量畜禽产品的快速筛查工作。

抗体是开展免疫检测的核心成分，获得特异性好、亲和力强的抗体已成为科研工作者追求的目标，而合成高效的人工抗原是获得高质量抗体的前提[10]。β-受体激动剂类药物属于小分子化合物，不具有免疫原性，只有将其与载体蛋白偶联后制备成完全抗原，才可刺激淋巴细胞产生特异性抗体，用于免疫分析。在大多数情况下，半抗原的活性基团不能直接与载体蛋白偶联，需要交联剂对其反应基团进行活化，只有这样才能在温和条件下与载体偶联。根据半抗原活性基团的不同，选择适当的偶联方法，得到偶联率均一、稳定的人工抗原，是合成方法的关键。本文基于常见的β-受体激动剂类药物不同的化学结构类型，对其人工抗原的合成和鉴定方法进行了综述，以期为小分子化合物免疫分析工作研究提供理论参考。

1 β-受体激动剂人工抗原合成

根据药物的化学结构，常见的β-受体激动剂类药物可分为苯酚型和苯胺型2 种，含有的活性基团分别为羟基（-OH）和氨基（-NH2），可直接利用该活性基团进行化学合成反应，也可以在羟基位引入含羧基（-COOH）的侧链，或将硝基（-NO2）通过还原反应得到氨基（-NH2），再与载体蛋白偶联。

1.1 苯酚型β-受体激动剂人工抗原合成

1.1.1 碳二亚胺法 碳二亚胺法通常以碳二亚胺为脱水剂，将分子中的羧基和氨基偶联形成酰胺键。该偶联条件温和、操作简便，但由于碳二亚胺没有选择性，为减少载体蛋白的羧基与氨基发生缩合，而导致载体蛋白之间偶联，一般是先将含羧基的半抗原与碳二亚胺活化，再加入载体蛋白反应，形成完全抗原。栗慧等[11]采用该方法制备特布他林人工抗原，获得了高灵敏度和特异性的特布他林多克隆抗体，血清效价达1:32 000 以上。

1.1.2 活泼酯法 活泼酯法是在碳二亚胺法的基础上优化的方法。通常在避光条件下，N-羟基丁二酰亚胺中的羟胺键与半抗原分子中的羧基反应，得到活性中间体，再与载体蛋白偶联，形成酰胺键；半抗原的羧基被活化后，更有利于与蛋白的氨基偶联形成新的酰胺键，避免了碳二亚胺对载体蛋白的直接作用，从而降低载体蛋白间的偶联，该方法在人工抗原的合成中应用广泛。陈观银等[12]采用该方法合成沙丁胺醇人工抗原，制备的抗体对沙丁胺醇的半数抑制浓度（IC50）为0.746 ng/mL，与其他同类结构药物的交叉反应率均小于0.015%，筛选出的杂交瘤细胞株培养上清液中抗体效价达1:128 000，小鼠腹水中抗体效价达1:2 560 000，具体合成路线如图1 所示。郭东光等[13]采用该方法合成齐帕特罗人工抗原，制备了特异性强、灵敏度高的齐帕特罗抗体，血清效价在1:6 400 以上，与克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、盐酸多巴胺、溴布特罗、西马特罗和特布他林等均无交叉反应。

图1 活泼酯法合成沙丁胺醇人工抗原技术路线图

1.1.3 混合酸酐法 混合酸酐法是在胺的作用下，分子中的羧基与氯甲酸异丁酯反应，生成混合酸酐活性中间体，再与载体蛋白偶联，得到相应的人工抗原，其操作过程简单，应用较为广泛。于洪侠等[14]采用该方法制备莱克多巴胺人工抗原，利用间接竞争ELISA 法检测到抗血清效价高于1:6 000，IC50为10 ng/mL，与克伦特罗、沙丁胺醇和特布他林的交叉反应率均小于0.01%，具体合成路线见图2。崔芳微等[15]采用该方法成功合成了沙丁胺醇人工抗原。沙丁胺醇与载体蛋白BSA 的偶联比为17:1，免疫后兔血清抗体效价为1:102 400，IC50为24.84 μg/L；特异性鉴定结果显示，沙丁胺醇多抗血清与侧链上含有叔丁基官能团的结构类似物具有较强的交叉反应，但是与其他同类分子（如齐帕特罗、西马特罗、莱克多巴胺和多巴胺等）不存在交叉反应。Liang 等[16]采用该方法合成了沙丁胺醇人工抗原，通过动物免疫及单抗制备，获得了灵敏度高、交叉反应性强的沙丁胺醇单抗，IC50为0.27 ng/mL，可以同时识别特布他林、西布特罗、克伦特罗和溴布特罗等38 种β-受体激动剂。

图2 混合酸酐法合成莱克多巴胺人工抗原技术路线图

1.1.4 琥珀酸酐法 琥珀酸酐法是将分子中游离的-OH 与琥珀酸酐反应，引入一个琥珀酸酐碳连接臂，生成含有活性-COOH 的半抗原，再与蛋白反应，得到暴露出母核结构的人工抗原。Wu 等[17]采用该方法得到沙丁胺醇人工抗原，制备的抗体灵敏度高，IC50为0.028 μg/L，与克伦特罗（139.6%）和溴布特罗（225%）具有高度交叉反应性，具体合成路线见图3。

图3 琥珀酸酐法合成沙丁胺醇人工抗原技术路线图

1.1.5 羰基二咪唑法 羰基二咪唑法基于化合物的羟基与羰基二咪唑反应，得到咪唑甲酸酯，然后载体蛋白中的N-亲核试剂进攻羰基，形成肽键，得到完全抗原。曹碧云[18]采用该方法合成了沙丁胺醇人工抗原，具体合成路线见图4。

图4 羰基二咪唑法合成沙丁胺醇人工抗原技术路线图

1.2 苯胺型β-受体激动剂人工抗原合成

克伦特罗、西马特罗等药物由于苯环具有伯氨基，属于苯胺型β-受体激动剂。氨基作为活性化学基团，常用的偶联方法有戊二醛法、重氮化法、异氰酸酯法、曼尼希反应法等。

1.2.1 重氮化法 重氮化法是含氨基药物人工抗原合成最常用的方法。在低温条件下，胺与亚硝酸盐在过量酸（比如盐酸）的作用下反应，生成重氮盐；再与蛋白质分子中酪氨酸残基邻位反应，得到人工抗原。Cao 等[19]采用该方法合成苯乙醇胺A 人工抗原，制备的抗体具有较高灵敏度，IC50低于0.48 ng/mL，与克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺等9 种该类药物的交叉反应率小于0.39%，具体合成路线见图5。职爱民等[20]采用该方法合成西马特罗人工抗原，经免疫试验证实，获得了高滴度的西马特罗抗体，抗血清效价均达1:1 000 以上，IC50为86.9 ng/mL。Wang 等[21]也采用该方法合成克伦特罗人工抗原，利用该抗原获得了具有广谱性的克伦特罗单抗，可识别23 种β-受体激动剂及其类似物，并建立了竞争抑制酶联免疫吸附分析方法。

图5 重氮化法合成苯乙醇胺A 衍生物人工抗原技术路线图

1.2.2 戊二醛法 戊二醛法反应条件温和，将含有氨基的半抗原、载体蛋白和戊二醛以五碳桥连接，形成半抗原-戊二亚胺-BSA 人工抗原。但该方法选择性差，容易造成载体间的偶联。王耀等[22]采用该方法将戊二醛分子中的两个醛基分别与盐酸阿可乐定和BSA 的氨基反应形成席夫碱，一步合成可乐定人工抗原，得到的人工抗原有较好的免疫效果，小鼠多抗血清效价达1:12 800 以上，IC50为82.75 ng/mL，具体合成路线见图6。

图6 戊二醛法合成可乐定人工抗原技术路线图

1.3 苯胺型和苯酚型β-受体激动剂二聚体人工抗原合成

大多数的人工抗原是一种半抗原偶联一种载体蛋白，只针对一类β-受体激动剂，检测目标也仅限于某一特定类型。多分析物免疫具有高通量、高效率和低样品消耗等优势，近年来多重识别特性的广谱抗体引起学者的关注。Liu 等[23]通过重氮化将克伦特罗（苯胺型β-受体激动剂）和莱克多巴胺（苯酚型β-受体激动剂）两种半抗原偶联到同一载体蛋白上，制备二聚体人工抗原，达到一次试验同时测定两类β-受体激动剂的效果，具体合成路线见图7。间接酶联免疫吸附法测定的滴度结果显示，2 只免疫新西兰兔产生的抗血清滴度均超过1:128 000，并将多克隆抗体与铕纳米颗粒结合形成探针，建立了基于铕纳米颗粒的荧光侧向流动免疫分析方法，可同时检测8 种苯胺类和1 种苯酚类β-受体激动剂。

图7 重氮化法合成克伦特罗和莱克多巴胺二聚体人工抗原技术路线图

2 β-受体激动剂人工抗原鉴定

人工抗原合成后，需要对产物进行鉴定或表征，以判断偶联是否成功，通常采用紫外光谱法、电泳法、红外光谱法和核磁共振法等进行鉴定。

2.1 紫外光谱法

由于药物、载体蛋白及二者偶联物的最大吸收波长不同，因此可以测定偶联前后最大吸收波长的变化，来证实完全抗原是否偶联成功，该方法操作简便，常用于人工抗原鉴定。宋珊珊等[24]比较了莱克多巴胺（RAC）、BSA 和RAC-BSA 的紫外光谱图，发现RAC、BSA 的紫外吸收峰分别在269、278 nm 处，RAC-BSA 在200～400 nm 处有特征吸收峰，且出现相应的光谱叠加现象，认为RAC 与BSA 偶联成功。

2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳法

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中根据分子大小不同而呈梯度分开，药物与载体蛋白结合后分子质量发生变化，使得电泳条带位置不同。周景明等[25]采用该方法鉴定克伦特罗人工抗原，发现BSA 及鸡卵清蛋白的涌动速度比偶联物的涌动速度快，偶联物的电泳条带较载体蛋白明显滞后，说明克伦特罗与载体蛋白偶联成功。

2.3 红外光谱法

红外光谱图具有高度专属性和特异性，根据谱图中吸收峰的波长、强度和形状可以判断分子中的基团，直观反映物质结构特征。刘红梅等[26]从RAC-BSA 红外光谱中看到3 294 cm-1处有氨基N-H 吸收峰，1 658 和1 538 cm-1处有酰胺吸收峰，说明含有BSA 结构；RAC-BSA 和RAC 在833 cm-1处有相似的吸收峰，而BSA 在此处无吸收，说明含有RAC 结构，据此推测RAC 和BSA偶联成功。

2.4 核磁共振法

核磁共振氢谱可以用来确定分子结构，每种含氢化合物都有自己独特的波谱图，通过不同的化学位移和自旋偶合来表征化合物结构。Lommen等[27]用该方法对非诺特罗抗原进行检测，分析氢化学位移特征，确定偶联反应成功。非诺特罗的特征化学位移在δ= 0.95、2.43、2.60、2.77、2.82、4.41、5.95、6.52 和6.82 处，经过20 h 的反应，这些共振（除δ= 5.95）降低到原始振幅的70%，在δ= 5.95 处共振几乎消失。该共振来自非诺特罗的双酚侧质子，其在高pH 值下与溶剂（D2O）中的氘缓慢交换，使非诺特罗共振振幅降低了30%，相当于平均30 个非诺特罗分子结合到1 个BSA分子中。于洪侠等[14]也通过核磁共振法鉴定了RAC-BSA 偶联物。

3 展望

免疫分析法具有操作快速、灵敏度高、检测成本低等优点，可以突破常规仪器分析的局限，在β-受体激动剂类药物残留检测中得到广泛应用。制备具有良好免疫原性的人工抗原，是免疫分析技术的基础。反应位点、连接臂及长度、载体连接方式和偶联比等都是影响人工抗原免疫原性的重要因素。计算机辅助药物设计、分子模拟技术等，由于可预测半抗原与潜在免疫特性之间的关系，有助于开发性能更稳定、免疫原性更高的人工抗原，近年来极大推动了半抗原分子结构设计和合成工作，具有较大的发展潜能。