白藜芦醇调控苹果响应轮纹病的差异表达基因分析

张洋红 李爽 陈昊伟 李佳 徐继忠

关键词：苹果轮纹病：白藜芦醇；转录组；差异表达基因

苹果属于蔷薇科苹果属，是我国主要的栽培果树之一，同时，我国也是苹果的原生地之一，在苹果属35个种中，有24个种原生于我国。我国是世界上最大的苹果生产和消费国，苹果种植面积和产量均超过世界总量的50%，但出口量极低，仅占2.5%。而影响苹果产量和品质的重要病害之一就是苹果轮纹病（apple ring rot），该病危害果实和枝干，严重时甚至造成幼树枯死等，严重制约我国苹果产业的发展。目前对苹果轮纹病的防治主要以化学防治为主，但大量使用化学农药，容易使病原菌产生抗药性，而且危害人体健康和环境。因此，需要在研究苹果抗病机制的基础上，挖掘抗病基因，选育抗病品种，开发植物源药剂，以对苹果轮纹病进行综合防治。

白藜芦醇（resveratrol）是一种天然多酚类物质，是植物体在抵御恶劣环境或病原侵害时分泌的一种抗毒素，主要存在于葡萄、花生和虎杖等植物中。目前，白藜芦醇在苹果轮纹病防治方面的研究尚未见报道，但在其它植物病原防治方面的研究已有报道。研究表明，白藜芦醇可以抑制葡萄上灰霉菌、根霉菌、拟茎点霉等病原真菌的生长，对番茄早疫病菌、灰霉病菌、霉心病菌、炭疽病菌以及石榴果实黑斑病菌的菌丝生长也具有抑制作用，还对杨树烟炭病菌、穿孔病菌、溃疡病菌以及草莓病原真菌（灰葡萄孢菌、胶孢炭疽菌、立枯丝核菌）具有不同程度的抑制作用：白藜芦醇处理砀山酥梨不仅具有一定的保鲜作用，还能显著延缓砀山酥梨货架期黑皮病的发生。此外，白藜芦醇作为植物代谢中的次生代谢产物，其合成与苯丙氨酸代谢途径密切相关，而苯丙氨酸代谢途径参与木质素、黄酮类、香豆素和芪类化合物等物质的合成，其中，木质素是植物组织的重要组成成分，可以保护植物免受各种致病菌的侵害。

转录组是指特定细胞或组织中的全部转录产物，目前，转录组技术已被广泛应用于研究植物细胞对致病菌的胁迫应答和病原菌的致病机理等方面。在苹果轮纹病相关研究中，洪坤奇等在苹果轮纹病菌侵染苹果枝条阶段的转录组研究中发现，与水解酶和果胶酶活性相关的基因以及与跨膜转运、蛋白翻译和糖类代谢相关的基因差异表达变化显著；水杨酸（SA）诱导处理苹果轮纹病不同抗性品种后的转录组表明，抗性品种的差异基因数量多，表明抗病品种的抗性相关基因更易受到SA的诱导。本研究通过对抗、感材料外源施加白藜芦醇后针刺法接种苹果轮纹病菌，观察病斑大小的变化，并将0h和96h的样品进行RNA-Seq测序分析，利用高通量测序技术探究白藜芦醇处理并接种轮纹病菌后不同抗性材料的基因表达变化情况，以期为深入探究白藜芦醇调控苹果抗轮纹病机制奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

抗病株系1-1-46和感病株系1-1-40，由河北农业大学苹果课题组从“鸡冠”和“富士”的杂交后代中选出。2017年将两种抗性株系分别嫁接于平邑甜茶上，常规管理。

1.2试验方法

分别选取抗、感材料当年生春梢顶端第5～7片完全展开的叶片，用500ug/mL白藜芦醇浸泡30min（Res处理），以蒸馏水浸泡为对照（CK）；待叶片表面水分自然晾干后进行针刺法接种苹果轮纹病菌，接菌方法参照韩林林的方法：观察病斑的变化，并选取接种0h和96h抗、感材料的Res处理和CK样品用于RNA-seq分析，每处理3个生物学重复，共24份样品。由北京百迈客生物科技有限公司完成测序。

1.3转录组数据的分析

1.3.1转录组测序用NanoDrop2000分光光度计检测RNA的纯度和浓度，用Agient2100/Lab-Chip GX精确检测RNA的完整性；用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；加入Fragmen-tation Buffer将mRNA随机打断：以mRNA为模板，合成第一条cDNA链及二链，并进行cDNA纯化；纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后通过PCR富集得到cDNA文库；之后进行文库质控，再使用Illumina NovaSeq6000测序平台进行PE150模式测序，测序工作由北京百迈客生物科技有限公司完成。

1.3.2与苹果参考基因组比对及基因功能注释

利用HISAT2将clean reads与苹果参考基因组（https：//iris. angers. inra. fr/gddh13/the-apple-ge-nome-downloads.html）进行比对得到Mapped Data后，进行文库质量评估、差异表达分析、基因功能注释等。

1.4实时荧光定量PCR分析

为验证转录组数据的准确性，从差异基因数据库选取9个基因，并利用Primer Premier 6.0设计引物（表1），分析实时荧光定量PCR结果是否与转录组结果一致。

2结果与分析

2.1白藜芦醇处理后叶片接种轮纹病菌的病斑大小变化

由图1可知，对照处理下，抗、感材料叶片接菌后，随时间推移，病斑面积逐渐增大，其中感病材料1-1-40的病斑面积增长较快。接菌72h后感病材料的病斑面积显著大于抗病材料，接菌144h时感病材料1-1-40的病斑面积为19.07mm2，显著高于抗病材料1-1-46的病斑面积（9.81mm2）。

抗、感材料经白藜芦醇处理后，接种轮纹病菌96～144h的病斑面積显著低于对照，均表现为抗病材料的病斑面积显著低于感病材料；144h时，感病材料1-1-40的病斑面积为17.04mm2，抗病材料1-1-46的病斑面积为6.41mm2。

2.2转录组测序数据质量评估

经测序质量控制，对白藜芦醇和对照处理后接菌0h和96h的24个样品的转录组数据进行分析，共获得173.80Gb Clean Data，各样品CleanData均达到6.05Gb，GC含量在46.07%～47.46%之间．Q20和Q30值分别在98.13%及以上和90.67%及以上（表2）。说明测序数据质量可靠，可满足后续分析。

2.3差异表达基因统计

以log2（Fold change）≥2且FDR（False Dis-covery Rate）<0.01作为筛选条件，对白藜芦醇处理后抗、感材料接种轮纹病菌Oh和96 h的差异表达基因（DEGs）进行分析，结果（表3）显示，感病材料1-1-40经白藜芦醇处理后接菌0h时（CKl_vs_T1）共有443个DEGs，其中上调表达的有1 84个，下调表达的有259个；抗病材料1-1-46经白藜芦醇处理后接菌Oh时（CK2-vs-T2）共有1855个基因差异表达，其中1240个上调表达，615个下调表达；感病材料经白藜芦醇处理后接菌96h时（T3-vs-T5）共有1596个DEGs，其中455个上调表达，1141个下调表达：抗病材料经白藜芦醇处理后接菌96h时（T4-vs=T6）共有2683个DEGs，其中1391个上调表达，1292个下调表达。

综合来看，白藜芦醇处理后，抗、感试材中的DEGs均是接菌96h的多于0h的，抗病材料的DEGs多于感病材料的：抗病材料中上调表达的基因多于下调表达的基因，而感病材料中则相反，下调表达的基因更多。说明抗病材料经白藜芦醇处理并接种苹果轮纹病菌后叶片内的基因表达模式变化比较激烈，而感病材料的变化则相对温和且以下调表达的基因较多。

进一步利用Venn图比较4个组的DEGs．由图2可知，对于上调表达的基因，在接菌Oh时，有105个仅在感病材料中特异表达，有909个仅在抗病材料中特异表达：接菌96h时，有292个仅在感病材料中特异表达，有1060个仅在抗病材料中特异表达。对于下调基因，接菌Oh时，有157个仅在感病材料中特异表达，有431个仅在抗病材料中特异表；接菌96h时，有894个仅在感病材料中特异表达，有1107个仅在抗病材料中特异表达。进一步说明抗病材料应对病菌侵染的基因表达模式较多。

2.4差异表达基因的GO功能注释

由表4可见，比较组CKl_vs_T1中的DEGs有373个注释到生物过程，518个注释到细胞成分，375个注释到分子功能；CK2-vs-T2中的DEGs有1670个注释到生物过程，有1961个注释到细胞成分，有1648个注释到分子功能；T3_vs_T5中的DEGs有1531个注释到生物过程，有1888个注释到细胞成分，有1467个注释到分子功能：T4_vs_T6中的DEGs有2612个注释到生物过程，有3082个注释到细胞成分，有2406个注释到分子功能。综合来看，4个比较组中的DEGs均以注释到分子功能中的结合能力和催化活性中的最多。

2.5差异表达基因KEGG通路富集分析

为进一步分析白藜芦醇处理后苹果轮纹病抗、感材料的DEGs在代谢通路中的功能，进行KEGG Pathway富集分析，结果（表5）显示，在P<0.05的情况下，抗病材料比较组间DEGs富集的代谢通路多于感病材料，接菌96h的DEGs富集到的通路多于0h的。

接菌0h，感病材料CK1_vs_T1富集的通路只有3条，富集到植物激素信号转导（plant hor-mone signal transduction，k004075）途径的基因数最多，为16个，其次是糖酵解／糖异生（glycolysis/gluconeogenesis，k000010）和花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism，k000590）途径，分别有7个和3个基因；而抗病材料CK2-vs-T2富集到13个通路，富集到植物一病原互作（plant-patho-gen interaction，k004626）途径的基因最多，为127个，其次是植物激素信号转导、MAPK信号通路一植物（MAPK signaling

pathway-plant，k004016）、淀粉和蔗糖代谢（starch and sucrose metabolism，k000500）、苯丙素生物合成途径（phenylpropanoid bi-osynthesis，k000940）。接菌96h，感病材料T3_vs_T5富集到6个通路，富集到植物一病原互作途径的DEGs最多，为131个，其次是植物激素信号转导、MAPK信号通路一植物、淀粉和蔗糖的代谢等途径；抗病材料T4-vs-T6富集到14個代谢通路，同样是富集到植物一病原互作途径的DEGs最多，为138个。

综合来看，富集到植物一病原互作通路的DEGs最多，其次是植物激素信号转导、MAPK信号通路一植物、淀粉和蔗糖代谢等通路。此外，抗病材料的比较组还富集到了与木质素合成相关的苯丙素生物合成途径，分别有39个和75个基因。

2.6转录组数据的qRT-PCR验证

为进一步明确转录组数据的准确性，从涉及的主要代谢通路中挑选出9个变化明显的差异基因进行qRT-PCR验证，分别是与植物一病原互作相关的基因MD14G1077700、MD14G1170900、MD10G1286300、MD10G1333100和与植物激素信号转导相关的基因

MD03G1273300、MD15G1225800、MD16G1178100、MD02G1165500、MD09G1042400。结果如图3所示，图中柱形为转录组测序结果，折线为qRT-PCR扩增结果。可见，两种数据虽在差异倍数上存在差异，但总体趋势相同，表明该转录组数据确切、可靠。

3讨论与结论

天然的白藜芦醇在植物遭到病原菌侵害时产生，对多种病原真菌具有显著的抗菌作用，同时被发现具有抗氧化和抗癌等作用。有研究表明，白藜芦醇和嘧霉胺联合使用，对葡萄灰霉病具有协同抗性，可抑制菌丝生长和分生孢子萌发。经白藜芦醇处理后的番茄叶片再接种早疫病菌，叶片病斑面积显著小于对照，且随白藜芦醇浓度的增大病斑面积逐渐减小，说明白藜芦醇可以在一定程度上保护番茄叶片免遭早疫病菌的侵害。Schulze等研究表明白藜芦醇对苹果黑星病菌孢子萌发无抑制作用，但能抑制其孢子的入侵，提高苹果叶片对黑星病菌的抵抗力。本研究用500ug/mL白藜芦醇处理苹果轮纹病抗、感材料的叶片后再接种轮纹病菌，相比于对照，病斑面积均减小，说明白藜芦醇对叶片起到一定的保护作用。

植物激素是植物体内合成的微量有机物，对其抗病性和生长发育具有显著作用。有研究表明，植物可以利用体内激素间的协同作用抵御病原菌的入侵。本研究中KEGG代谢通路的分析结果显示，苹果轮纹病抗、感材料中富集在植物激素信号转导途径的DEGs较多，抗病材料比较组接菌0h和96h富集到该途径的DEGs分别为127个和138个，而感病材料0h和96h富集到该途径的DEGs分别为16个和131个，说明抗病材料体内有丰富的抗性系统，可在病原菌侵染后立刻做出反应，而感病材料反应相对缓慢。

苯丙烷代谢途径在植物的抗病系统中发挥着重要作用，其产物木质素、类黄酮和植保素等是植物抗逆防御反应不可或缺的，对真菌和细菌具有抑制活性。类黄酮可以提高植物自身的防御能力，如激活水杨酸、脱落酸等逆境响应激素的信号通路，以应对外界环境的刺激，提高植物的抗病性。本研究中白藜芦醇处理后苹果轮纹病抗性材料中DEGs在苯丙素和类黄酮生物合成途径也有显著富集，而感病材料中没有，因此推测苯丙素和类黄酮生物合成途径与苹果轮纹病抗性相关。此外，有研究表明，部分ABC转运蛋白影响病原真菌的致病力，葡萄孢菌中已克隆了14個ABC转运蛋白，且已证实其中Bcatr B、Bcatr D和Bcatr K 3个蛋白与多药抗性有关。而本研究中ABC转运蛋白途径也在抗病材料中被显著富集。

遭受病原菌侵染时，不同植物的反应机制不同。类钙调蛋白（calmodulin-like protein，CML）是植物细胞中的钙离子结合蛋白，在植物生长发育和逆境胁迫的信号转导中具有重要功能，主要通过调节各类靶点而在细胞信号网络中发挥关键作用，从而响应植物胁迫应答反应和系统发育。本研究中，在植物一病原互作途径发现多个CML基因（CML42、CML49、CML36、CML50），在抗病材料中，与对照相比，白藜芦醇处理后除CML50呈现下调表达趋势外，其他均呈显著上调表达趋势：而在感病材料中，这些基因的表达变化并不明显，说明在抗病材料中Ca2+信号被激活，也参与了苹果轮纹病菌入侵信号调控的抗病反应。

综上所述，白藜芦醇处理能显著降低苹果轮纹病抗、感材料叶片接菌96～144h的病斑面积；白藜芦醇处理后抗病材料各比较组的DEGs及其富集的代谢通路均多于感病材料。白藜芦醇能在一定程度上提高苹果的轮纹病菌抗性。