马铃薯野生近缘种抗PVY种质资源分子标记辅助筛选

于韶玮 张剑峰 杨元军 迟胜起

关键词：马铃薯野生近缘种；马铃薯Y病毒；病毒抗性；分子标记辅助选择

马铃薯是茄科一年生草本双子叶植物，起源于南美洲安第斯山脉、加勒比地区及北美洲南部的墨西哥]，是重要的粮菜兼用作物。生产中马铃薯以无性繁殖为主，易造成种薯病毒积累而导致种性退化，而且当季病毒侵染亦可造成产量损失和品质变劣。研究表明病毒病可引起马铃薯减产30%～60%，复合侵染可减产80%。马铃薯易感多种病毒，其中马铃薯Y病毒（potato vi-rus Y，PVY）导致经济损失最大且毒株繁杂多变，自1931年首次报道至今，已有PVY0、PVYC、PVYN、PVYNTN、PVYNN、PVYN：0等多种变异或重组株系。茎尖脱毒可有效缓解病毒导致的马铃薯种性退化问题，但脱毒种薯培育程序繁琐，成本居高不下，而且若病毒检测不到位，则难以保证质量，还易被再次侵染。选育和种植抗病毒品种是防治马铃薯病毒病最经济有效的途径。

马铃薯四倍体（2n= 4x=48）普通栽培种（So-lanum tuberosum L．）中PVY抗源相对匮乏，但其野生近缘种中含有多种来源的PVY抗性基因Ry，如果将Ry基因转入普通栽培种中，则可以有效提高栽培种的PVY抗性。目前已经报道的Ry基因主要有Ry dg、Ry和Ry其中，Ry来源于马铃薯栽培种安第斯亚种（S．tuberosumssp. andigena），与之连锁的分子标记为RY-SC3源自葡枝薯（S．stoloniferumSchlechtdal），与之连锁的分子标记为YES3-3A；Ry源自恰柯薯（S．chacoense Bitter），与之连锁的分子标记为Ry364。为有效利用PVY抗源，本研究应用上述3个Ry基因的分子标记对56份马铃薯野生近缘种进行筛选，获得了含有PVY抗性分子标记的种质资源，可用于抗PVY马铃薯品种的选育。

1材料与方法

1.1试验材料

供试植物材料为56份马铃薯野生近缘种的试管苗。这56份近缘种来自14个种，其中二倍体（2n=2x=24）种质资源23份，四倍体（2n=4x=48）种质资源14份，六倍体（2n=6x=72）种质资源15份，未确定倍性的种质资源4份（表1）。这些种质资源主要来自南美洲安第斯山区及墨西哥等马铃薯起源地，少数来自荷兰、美国、俄罗斯，以及山东省农业科学院蔬菜研究所利用野生种创制的新种质材料。

1.2试验方法

1.2.1试管苗扩繁与保存 将带有一个腋芽的马铃薯野生近缘种试管苗茎段接种至含有MS培养基的试管中，于培养室中2000lx、22～25℃、光／暗周期为14h/10h条件下培养。

1.2.2DNA提取与检测参考Edwards等的方法，稍加改动。用镊子取0.1g马铃薯试管苗茎叶至1.5mL无菌Eppendorf离心管中，加入400uL提取液（200mmol/L、pH 7.5的Tris-HCl，250mmol/LNaCl， 25mmol/L EDTA， 0.5%SDS），用研棒充分研磨至糊状，漩涡振荡5s，室温静置1～2h；Eppendorf Centrifuge 5810R‘离心机13000×g离心1min;取300uL上清至新的无菌离心管中，加入300uL异丙醇，室温静置2min；13000xg离心5min，弃上清，将沉淀室温干燥后溶解在100uL1xTE溶液中，-20℃冰箱保存。提取的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳、BIO-RAD Gel Doc EZ Im-ager凝胶成像系统检测质量。

1.2.3分子标记辅助筛选抗PVY种质资源选择3个不同来源的PVY抗性基因Ry和Ry及其分子标记（RYSC3、YES3-3A和Ry364）进行抗性种质资源筛选（表2）。PCR反应体系按照EasyTaq

DNA Polymerase for PAGE试齐0盒操作指南进行。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2结果与分析

2.1携带Ry基因分子标记RYSC3的种质资源筛选

对56份材料进行PCR筛选，结果（表3、图1）表明，含有Ry抗性基因连锁标记RYSC3的材料有13份，占比23.21%，包括二倍体材料3份，四倍体材料6份，六倍体材料4份。其中来自玻利维亚的二倍体腺毛薯（S．berthaultii Hawkes）茎叶生有毛状腺体，对蚜虫等介体传播马铃薯病毒兼具物理抵御作用。

2.2携带基因分子标记YES3-3A的种质资源筛选

含有抗性基因分子标记YES3-3A的材料有4份，占比7.14%（表3）。其中，二倍体材料1份，为球栗薯（S．bulbocastanum Dunal）；四倍体材料2份，分别为葡枝薯和无茎薯（S．acaule Bit-ter）；染色体倍性末确定材料1份，为葡枝薯。

2.3携带Ry基因分子标记Ry364的种质资源筛选

含有Ry抗性基因连锁标记Ry364的种质资源23份，占比41.07%，包括二倍体材料6份，四倍体材料4份，六倍体材料12份，染色体倍性未知材料1份（表3、图2）。其中，二倍体S．com-mersonii Dunal、四倍体S．acaule Bitter、六倍体S．albicans Ochoa的一些种质资源携带抗寒基因，六倍体S．demissum Lindley的一些种质资源含有晚疫病抗性基因，为选育同时具有PVY抗性和这些优良性状的优良品种提供了种质材料。

综合来看，含有RYSC3、YES3-3A、Ry364中两种及以上标记的材料共有7份，占比12.5%，其中，二倍体材料2份，四倍体材料1份，六倍体材料4份，且仅四倍体材料OCH 14180a（S．stolo-niferum Schlechtdal）含有3种标记（表3）。

3讨论与结论

生产中马铃薯以无性繁殖为主，多季种植造成块茎中病毒大量累积，导致马铃薯种性退化、脱毒种薯不合格。茎尖脱毒技术可有效降低病毒病的危害，但近年来利用该技术生产的脱毒种薯的繁殖代数越来越少，已由原来的5～6代缩短至1～2代，造成這一现状的主要原因就是病毒再侵染造成的种薯退化。鉴于此，选育和栽培抗病毒品种是马铃薯抗病毒病最经济有效的途径。目前马铃薯抗病毒育种的首要目标是抗PVY，野生资源中含有丰富的抗性基因，利用分子标记从野生近缘种中筛选出抗PVY的种质资源，可以拓宽马铃薯的遗传背景，为抗性育种提供适宜的抗源，提高抗病毒育种的精准度。

马铃薯染色体倍性复杂，目前全球除起源地外，生产上种植的主要为四倍体，但种质资源中从单倍体（monoploid）到七倍体（hepta-ploid）均有存在，常见的有二倍体、四倍体和六倍体。高倍性的四倍体、六倍体种质资源基因组高度杂合，在有性杂交过程中不良基因难以去除。二倍体的遗传背景则相对简单，如果能克服自交不亲和引起的衰退问题，就可以同其他二倍体茄科作物一样，利用二倍体马铃薯通过多代自交剔除有害基因获得优良自交系，进行杂种优势育种，然后用二倍体实生种子有性繁殖代替四倍体块茎无性繁殖，节约种薯储藏和运输成本，避免种薯携带病毒：也可通过2n配子将优良基因渗入到四倍体栽培种中，在四倍体水平育种：还可以将四倍体降为二倍体，或者诱导二倍体获得单倍体，再加倍获得纯合二倍体，从而在二倍体水平上进行优良性状聚合育种，也可作为转基因或基因编辑受体材料，用于基因功能鉴定及种质创新。本试验引进的野生近缘种主要来自南美安第斯山区，其中部分二倍体经过起源地多年的自然选择，实生苗未观察到明显的表型分离，显示这些种质资源可以自交结籽且遗传背景纯合度大为提高，在纯合二倍体稀缺的情况下，这些二倍体种质资源为进一步人工自交提高纯合度提供了便利。

本试验利用PVY抗性分子标记RYSC3（连锁Ry）、YES3-3A（连锁Ry）和Ry364（连锁Ry），对56份马铃薯野生近缘种进行筛选，从中选出含有标记RYSC3的种质资源13份，含有标记YES3-3A的种质资源4份，含有标记Ry364的种质资源23份，包括物理防御蚜虫传播病毒的二倍体腺毛薯（S. berthaultii Hawkes）、耐霜冻的二倍体S．commersonii Dunal以及携带晚疫病抗性基因的六倍体S．demissum Lindley；其中，有7份种质材料含有2种标记，有1份种质材料即四倍体葡枝薯OCH 14180a含有3种标记。这些种质资源可用于马铃薯抗PVY育种及抗性基因挖掘。

筛选出携带PVY抗性分子标记的种质资源，还需对其后代继续进行分子标记辅助选择及病毒抗性鉴定。通过杂交获得實生籽家系，在鉴定单株PVY抗性过程中，除检测分子标记外，还需结合接种病毒对单株病毒抗性进一步筛选。在抗PVY后代中，有些单株可以检测到分子标记，但田间仍然表现PVY感染的症状，推测可能是染色体片段发生了交换，致使原来连锁的标记和抗性基因发生了分离。另外，可能存在分子标记无法检测到的新PVY抗源。本试验选用的种质资源中有些检测不到RYSC3、YES3-3A和Ry364分子标记，但植株在接种病毒或田间开放条件下仍然表现出抗PVY的特性，需要进一步深入分析其原因，明确是因为携带新的PVY抗性基因，还是累积了病毒但未表现出典型的PVY感病症状，如果是后者则需剔除，避免成为传播PVY的毒源。