食管鳞癌p53、TSP-1、VEGF表达与肿瘤血管生成

丁旭青， 韩玉培

肿瘤生长和转移有赖于血管生成。血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)是有效的血管生成抑制因子[1]，而血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管生成促进因子[2]，p53通过调节TSP-1和VEGF的表达来影响肿瘤血管的生成[3]。我们采用免疫组化SP法检测了68例食管鳞癌组织中p53、TSP-1及VEGF的表达及肿瘤微血管密度(microvessel density，MVD)，以探讨其在食管鳞癌血管生成中的意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选取南阳市第二人民医院胸外科2007年9月至2009年3月食管癌手术切除标本68例，术前患者未经任何抗肿瘤治疗，术后常规病理切片证实为鳞癌。其中男性52例，女性16例，年龄34～76岁，中位年龄55岁。组织学分级：高中分化鳞癌35例，低分化33例。TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期29例，Ⅲ～Ⅳ期39例。

1.2 试剂 鼠抗人TSP-1单克隆抗体、鼠抗人p53单克隆抗体(突变型)、鼠抗人VEGF单克隆抗体、鼠抗人CD31单克隆抗体，均购自北京中山生物技术有限公司。

1.3 p53(突变型)检测 p53阳性表现为细胞核中出现清晰棕黄色颗粒，单纯胞浆着色尚无胞核着色或均无着色为阴性细胞。按阳性细胞占癌细胞的比例分为4个等级：未见阳性细胞为(-)，阳性细胞<25%为(+)，25%～50%为(++)，>50%为(+++)。为方便统计分析，将(-)；(+)定为阴性组，将(++)、(+++)定为阳性组。

1.4 TSP-1检测 TSP-1定位胞浆，呈棕黄色颗粒。无阳性细胞为阴性；阳性细胞数< 10%为弱阳性，10%～50%为阳性，>50%为强阳性。将阴性和弱阳性定为阴性组，将阳性和强阳性定为阳性组。

1.5 VEGF检测 VEGF判定标准：VEGF胞浆着色，呈棕黄色颗粒状。阳性细胞数≥30%者判为阳性。

1.6 MVD检测 按照Weidner[4]的评判标准，凡呈现棕色单个细胞或内皮细胞群者均作为1个血管计数，但肌层较厚及管腔面积>8个红细胞直径的血管不计数。每张切片选择3个血管较多的癌间质区，在200倍视野下进行血管计数，每例标本分别计数5个视野，取其平均值。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件包进行t检验、χ2检验和Spearman相关分析。检验水准α=0.01。

2 结果

2.1 p53、TSP-1、VEGF和MVD的表达 p53阳性染色主要位于癌细胞核内，总阳性率为72.06%；TSP-1 和VEGF棕黄色染色主要位于肿瘤细胞胞浆，间质亦有轻微着色，总阳性率分别为29.41%和64.71%；肿瘤组织内微血管经CD31染色后，呈棕色或棕黄色，管腔清晰，也可见条索状血管，其MVD平均值为24.085±5.605。

2.2 p53与TSP-1的关系 p53阳性表达49例中，TSP-1阳性8例，阴性41例；p53阴性表达19例中，TSP-1阳性12例，阴性7例。Spearman相关分析表明，p53与TSP-1显著负相关(χ2=20.000，rs=-1.000，P<0.01)。

2.3 p53与VEGF的关系 p53阳性表达49例中，VEGF阳性41例，阴性8例；p53阴性表达19例中，VEGF阳性3例，阴性16例。Spearman相关分析表明，p53与VEGF显著正相关(χ2=44.000，rs=1.000，P<0.01)。

2.4 TSP-1与MVD的关系 TSP-1阳性组MVD均值为18.37±4.86，阴性组为29.80±6.35，两组比较差异有统计学意义(t=2.735，P<0.01)。Spearman相关分析发现，TSP-1阳性表达与MVD呈负相关(rs=-0.783，P<0.01)。

3 讨论

p53基因有野生型和突变型之分。正常细胞中野生型p53基因参与细胞周期的调控，可以阻止细胞于G1/S期，一旦突变则可导致细胞恶性增殖，产生癌变。近年研究发现，p53基因突变与多种肿瘤如胃癌、贲门癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等的血管生成和不良预后相关[5]。因野生型p53半衰期短，不易检测，研究中多采用突变型p53。本研究结果支持上述结论，p53阳性患者其血管生成丰富，提示p53阳性细胞具有较强的转移特性。

研究表明肿瘤的生长及转移依赖于血管形成。TSP-1是一种多功能细胞外基质糖蛋白，属于TSP家族成员之一[1]。TSP-1是肿瘤血管形成抑制因子，近年来发现TSP-1可由多种肿瘤细胞合成分泌，在调节肿瘤细胞的粘附迁移以及新生血管形成中发挥重要作用。Tolsma等[6]发现抗TSP-1抗体可消除TSP-1对血管新生各阶段的抑制作用。Moon等[7]的研究表明某些癌症患者发生“肿瘤休眠”的分子基础是TSP-1，TSP-1能够使肿瘤转移降低15～20倍，提示TSP-1具有强大的抑制肿瘤转移作用。我们发现食管鳞癌组织中TSP-1表达下调，且其表达与MVD呈负相关，提示TSP-1与食管鳞癌的血管形成有关，其表达水平升高可抑制血管生成。

近来发现野生型p53可以上调TSP-1的表达而抑制血管新生，而突变型p53则下调TSP-1表达促进血管新生[3]。Iddings等[8]证明静脉导入携有p53 基因的阳离子脂质体DNA复合物可有效抑制荷瘤鼠肿瘤生长和转移，并发现通过刺激TSP-1合成而抑制瘤体内血管新生是p53抑癌效应的一个重要机制。本研究显示p53的表达与TSP-1表达密切相关，突变型p53表达增高时，TSP-1表达下降，反之TSP-1表达上升，表明突变型p53对TSP-1基因具有负向调节作用。

近年来研究还发现，野生型p53可抑制酪氨酸蛋白激酶介导的VEGF的上调，而突变型p53则可通过激活蛋白激酶C(protein kinase, PKC)上调VEGF。Linderholm等[9]发现乳腺癌组织中p53阳性表达组VEGF值明显高于p53阴性组。本实验在食管鳞癌中也发现p53阳性组的VEGF表达高于阴性组，经Spearman相关分析发现，突变型p53与VEGF呈正相关。由此可见，突变型p53可导致VEGF过表达，刺激血管、淋巴管新生，促进肿瘤转移。

综上所述，p53通过调节TSP-1和VEGF的表达而影响肿瘤组织血管生成。突变型p53不但抑制TSP-1的表达，同时又刺激了VEGF的转录，进而促进了食管鳞癌组织的血管生成。3种因子的检测对研究食管鳞癌的侵袭与转移有着重要的意义。

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[6] Tolsma SS, Stack MS, Bouck N. Lumen formation and otherangiogenic activities of cultured capillary endothelial cell are inhibited by thrombospondin-1[J]. Microvasc Res,1997,54(1):13-26.

[7] Moon Y, Bottone FG Jr, McEntee MF, et al. Suppression of tumor cell invasion by cyclooxygenase inhibitors is mediated by thrombospondin-1 via the early growth response gene Egr-1[J]. Mol Cancer Ther, 2005，4(10):1551-1558.

[8] Iddings DM, Koda EA, Grewal SS, et al. Association of angiogenesis markers with lymph node metastasis in early colorectal cancer[J]. Arch Surg，2007，142(8):738-745.

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