罗非鱼血液和肌肉中土霉素萃取方法的研究

王伟利　段建伟　罗　理　姜　兰　邹为民

摘要通过HPLC方法对土霉素对照品进样分析，绘制了土霉素的标准曲线，线性方程为y=355 00 x+238，检测限为0.002 5μg/mL，定量限为0.005μg/mL，在0.005~10.000μg/mL之间线性关系良好，相关系数R=1.000 0。使用乙酸乙酯和不同体积高氯酸萃取，发现：使用乙酸乙酯萃取效率略低于5%高氯酸，但因为沸点低易于浓缩的优势，在满足试验要求的前提下可以考虑使用乙酸乙酯萃取；对于血液和肌肉中土霉素的萃取，考虑时间和试剂消耗，10mL的5%高氯酸1次萃取即可满足一般检测需求。

关键词土霉素；回收率；变异系数；固相萃取

中图分类号X836文献标识码A文章编号1007-5739（2009）07-0203-02

土霉素是四环素类药物，作用机制是通过与核糖体30s亚基的特异性结合，抑制肽链延长和蛋白质合成；抗菌谱广，对革兰氏阳性和阴性细菌均有抑制作用。近年来，由于耐药性严重，已经减少了其在生产、临床上的使用。由于土霉素在可食性产品中的残留会对骨骼和牙齿产生不可逆的色素沉着等不良影响。因此，控制土霉素的使用，实施对动物性食品中土霉素及有害代谢产物残留的检测十分重要。世界粮农组织、世界卫生组织、欧盟及我国政府对鱼肉中土霉素的残留都做出了严格的规定，其残留限量不得高于0.1mg/kg。

有关土霉素的药代动力学方面的研究已经见有很多报道，多数通过0.5%~5.0%高氯酸萃取和固相萃取小柱进行净化处理，但是由于高氯酸难以浓缩，使用固相萃取小柱净化、有机溶剂洗脱，虽然易于浓缩，但成本较高。

本试验以罗非鱼为研究对象，通过比较乙酸乙酯和高氯酸对土霉素的萃取效果、不同剂量高氯酸萃取回收率、高氯酸对组织中土霉素的回收率及固相萃取中不同溶剂洗脱杂质的回收效果等，以期对于水产动物组织中土霉素萃取方法的选择提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1仪器。Water 2695高效液相色谱仪、2487紫外检测器，SUPELCO VISIPREP 24TM DL固相萃取仪，美国Orga-nomation N-EVAPTM 112氮吹浓缩仪，德国IKA T18匀浆机，SIGMA 3K158离心机，瑞士METTLER TOLEDO的pH计和分析天平，太仓市科教器材厂VORTEX SHAKER WH-861型振荡器。

1.1.2试剂。土霉素对照品（中国药品生物制品检定所，批号130487-200302，含量88.2%）；乙腈、甲醇、正己烷均为HPLC级；乙二胺四乙酸二钠为超级纯，MBCHEM公司产品；硝酸、乙酸乙酯、高氯酸、磷酸二氢钠等均为分析纯；Waters OASIS HLB 3cc/60mg固相萃取柱；试验用罗非鱼由珠江水产研究所基地提供。

1.1.3试剂的配制。土霉素储备液：称取土霉素对照品0.01g溶于100mL、pH值2.5、0.01moL的NaH2PO4，4℃保存，1个月内有效；5%乙二胺四乙酸二钠溶液：取5g的EDTA-2Na用蒸馏水定容至100mL；0.01moL的NaH2PO4：称取1.56g的 NaH2PO4·2H2O溶于蒸馏水中，定容至1 000mL，以硝酸调节pH值至2.5，0.45μm滤膜过滤后备用。

1.2试验方法

1.2.1液相色谱条件。根据水产品中土霉素残留量的测定SC/T 3015-2002标准，略有调整；色谱柱：Waters Atlantis C18，5μm，4.6mm×150mm Column；检测器：Waters 2487紫外检测器；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量：20μL；流动相：乙腈-0.01moL磷酸二氢钠溶液=26-74。

1.2.2标准曲线的绘制。将土霉素对照品储备液稀释至10 μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL、0.002 5 μg/mL，按上述色谱条件进样检测。

1.2.3样品准备。试验用罗非鱼10条（平均体重200±10g），经检测血液和肌肉中不含土霉素。采集血液使用0.1%的肝素钠抗凝，准确定量均分至1mL/份；背部两侧肌肉去磷片、去皮，准确定量均分至1g/份。

1.2.4乙酸乙酯与高氯酸萃取回收率比较。取血液2份，分别加入1μg/mL土霉素对照品，回旋振荡器振荡5min；分别用1mL的5%高氯酸和1mL乙酸乙酯萃取，方法如下：匀浆30s；振荡3min；5 000rpm 离心5min；取上清液0.45μm滤膜过滤后上样检测。

1.2.5不同剂量萃取剂回收率比较。分别取血液和肌肉各4份，血液和肌肉各取1份作为空白对照，其余分别加入土霉素1μg；用5%高氯酸1mL、10mL和10mL（2次）萃取回收检测。

1.2.6固相萃取不同溶剂洗脱杂质回收效果比较。取血液2份，分别添加1μg、0.1μg的土霉素，使用10mL的5%高氯酸萃取，Waters Oasis HLB固相萃取小柱净化。洗脱杂质程序中，分别采用5%甲醇水和ddH2O洗脱，计算相对回收率。固相萃取程序如下：①依次用3mL甲醇、2mL的5%EDTA-2 Na、3mL的ddH2O平衡萃取柱；②萃取液过柱；③用5mL的5%甲醇水洗脱杂质或者ddH2O洗脱杂质；④负压下抽干2min；⑤5mL甲醇洗脱样品；⑥氮吹仪40℃水浴吹干，pH值2.5的0.01moL的NaH2PO4定容至1mL；⑦振荡器振荡1min，液相检测。

2结果与分析

2.1标准曲线与回归方程

土霉素标准工作液在0.005~10.000μg/mL之间线性关系良好，检测限达0.002 5μg/mL，定量限为0.005μg/mL，线性方程为y=35 500x+238，线性相关系数R=1.000 0（见图1）。

2.2乙酸乙酯与5%高氯酸萃取效果比较

乙酸乙酯和高氯酸的回收率分别为50.3%、58.3%。高氯酸萃取回收率较乙酸乙酯高；乙酸乙酯萃取杂质较多，但均与土霉素峰形分离完全。由于乙酸乙酯沸点低（77.2℃），容易浓缩，故在满足检测要求的前提下，为了节约样品浓缩处理时间，乙酸乙酯仍是个较好的选择（见图2）。

2.35%高氯酸不同剂量萃取效果比较

在增大萃取剂用量的情况下，萃取效率明显提高，但是1∶10之后，继续增大萃取剂用量，回收率提高不大。在试验要求允许的情况下，为了节约试剂、时间及浓缩的方便，1∶10萃取较好（见表1）。

2.4固相萃取不同溶剂洗脱杂质回收效果比较

5%的甲醇水洗脱杂质回收率明显低于ddH2O效果，表明5%甲醇水会洗脱少量被分析物土霉素；同时随着样品中土霉素含量的提高，洗脱的比例也增加（见表2）。

3讨论

（1）乙酸乙酯为低沸点的有机溶剂，常用于血液等组织中痕量物质的回收处理。相对于常用的高氯酸和Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液萃取方法，乙酸乙酯具有回收率接近，易于浓缩的优势。

（2）国标SC/T 3015-2002方法中，5%高氯酸萃取后，使用正己烷去除样品中的脂质。本试验过程中经过比较，发现对于血液等脂肪含量少的组织，不进行除脂步骤不影响后期检测。

（3）土霉素的固相萃取方法多使用C18或HLB固相萃取小柱进行，均达到较好效果，其中HLB小柱的回收率及稳定性优于C18。在净化过程中，文献中多使用5%甲醇水或ddH2O洗脱杂质，其中Waters HLB推荐用法为5%甲醇水。本研究使用Waters HLB小柱净化回收，发现使用ddH2O洗脱杂质对土霉素的回收率在高中低（10μg、1μg、0.1μg）3个浓度加标量土霉素的回收率均在90%左右，高浓度回收率更达98.1%，明显高于5%甲醇水洗脱杂质。

4参考文献

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