斑点叉尾鮰暴发性败血症的免疫预防研究

苏应兵，杨代勤 (长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

斑点叉尾鮰暴发性败血症的免疫预防研究

苏应兵，杨代勤 (长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

通过试验确定了嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)全菌苗的福尔马林安全灭活浓度、最佳灭活温度及时间，并选取最佳灭活方式，制备了全菌苗F-1、F-2和F-3。采用所得全菌苗免疫斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)，测定了其对斑点叉尾鮰的免疫原性。经注射接种28 d后，受免斑点叉尾鮰血清中凝集抗体效价都有显著增加。受免斑点叉尾鮰血液白细胞吞噬活性的测定结果表明，3个免疫组的吞噬百分比和吞噬指数都显著地高于对照组。这表明，采用福尔马林灭活的全菌苗F-1、F-2和F-3，均能在28 d内刺激斑点叉尾鮰产生较强的免疫应答。

斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)；白细胞吞噬活性；免疫预防

随着斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)养殖在全国各地的推广，养殖产量大幅度提高，集约化生产能力加大。但其病害发生也日趋严重，尤其是苗种培育阶段和成鱼的后期养殖，各种病原体侵袭引发斑点叉尾鮰暴发性死亡时有发生，极大地影响了斑点叉尾鮰的产量、效益，病害已成为影响斑点叉尾鮰规模化生产的“瓶颈”因素之一。目前，水产养殖者普遍使用抗生素等化学药物来控制，一方面使致病病原体的抗药性不断增加，使机体的细胞免疫、体液免疫功能下降[1]；另一方面，对环境会造成严重的污染和破坏，同时，药物残留还会对食用者构成潜在的威胁[2]。随着对绿色环保食品和环境保护的要求及免疫学技术的发展，国内外已有通过接种疫苗进行水生生物疾病控制的报道[3]。在我国，对疫苗免疫机理的研究多集中于血清抗体浓度和效价的提高等特异性体液免疫方面[4]。本研究通过确定嗜水气单胞菌全菌苗的福尔马林安全灭活浓度和最佳灭活温度及时间，选取最佳灭活方式，制备嗜水气单胞菌和温和气单胞菌灭活全菌苗；同时，用全菌苗免疫斑点叉尾鮰后，分析其免疫指标和疫苗对斑点叉尾鮰的保护率，即凝集抗体效价、白细胞吞噬活性和免疫保护率，旨在探讨采用灭活疫苗预防斑点叉尾鮰暴发性败血症的可能性，为斑点叉尾鮰的健康养殖提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

用于制备免疫原的菌株是从3种表现出血症状的患病斑点叉尾鮰中分离得到的3株致病病原菌，分别记为Jh-1、Jh-2和 Yh-3。经分离、纯化和鉴定，确定菌株Jh-1属嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)，菌株Jh-2和 Yh-3均属温和气单胞菌(Aeromonassobria)(另文发表)。

吞噬实验所用金黄色葡萄球菌(staphylococcusaurreus)由长江水产研究所鱼病室提供。试验用健康斑点叉尾鮰取自长江水产研究所良种繁育基地，体长(16.5±1.0) cm，体重(39.0±0.5) g，暂养1周后备用。

1.2 免疫原的制备

将菌株Jh-1接种于普通蛋白胨牛肉膏液体培养基(pH7.2)，28 ℃恒温摇床(150 r/min )培养18 h后，平板法测定细菌浓度，用无菌生理盐水(0.5%,W/V)稀释至5.0 × 109cfu/mL后，分组分别加入终浓度为0%、0.1%、0.2%、0.4%的福尔马林，置4、28、60 ℃分别灭活，按设定时间取出灭活的菌液在无菌条件下3 000 r/min，30 min离心，去上清，再加入等量0.5%(W/V)鱼用生理盐水，然后划线接种于FWA平板上，28 ℃恒温培养24 h后，观察菌落生长情况，从而检测灭活效果，确定福尔马林安全灭活浓度和最佳灭活温度。选取最佳灭活方式分别灭活Jh-1、Jh-2、Yh-3 3株菌株，灭活完成后，即分别得到对应的福尔马林灭活的嗜水气单胞菌(formalin killedA.hydrophila，F-1)和温和气单胞菌全菌苗(formalin killedA.sobria，F-2和F-3),置4℃冰箱保存备用。

1.3 菌苗的安全性试验

选取健康斑点叉尾鮰，胸鳍基部注射按前面所制得的灭活全菌苗F-1、F-2和F-3，每种菌苗各注射10尾，注射剂量为0.2 mL/尾，对照组10尾，注射等量无菌生理盐水(0.5%，W/V) ，饲养15 d，观察并记录斑点叉尾鮰的活动情况。

1.4 金黄色葡萄球菌悬液的制备

将金黄葡萄球菌接种在液体肉汤培养基(上海生物制品厂出品)中，37 ℃下培养48 h，离心集菌，在菌液中加入浓度为0.5%的福尔马林，37 ℃条件下灭活24 h，用灭菌生理盐水清洗3次，并将其浓度稀释至1.0×108cfu/mL，即为福尔马林灭活的Staphylococussaurreus菌体(formalin killedS.aurreus，F-SA)，用作检测白细胞吞噬活性。

1.5 免疫与采血

将健康斑点叉尾鮰分为3个免疫组和1个对照组，每组30尾，其中免疫组每尾从胸鳍基部注射0.2 mL菌浓度为1.0×108cfu/mL的灭活全菌苗；对照组每尾从胸鳍基部注射0.2 mL无菌生理盐水(0.5%，W/V)。免疫后第28 d从各组中随机取6尾鱼，断尾采血。将每尾鱼的血液均分为2份，1份置常温下凝血后分离血清，供检测凝集抗体效价用；另1份以肝素(1%肝素钠)抗凝，供分离白细胞测定其吞噬活性之用。

1.6 凝集抗体效价的测定

采用96孔血凝记数板进行。反应抗原为F-1、F-2和F-3菌苗。加样后的血凝板首先在30 ℃条件下孵育1 h，然后置于4 ℃冰箱中，翌晨判定其结果。

1.7 白细胞吞噬活性的测定

在0.2 mL抗凝血中加入0.1 mLF-SA，摇匀，在28 ℃的恒温水浴锅中孵育45 min，每隔10 min摇动1次。用吸管吸取血细胞涂片，每个样品涂5张，用甲醇固定10 min，Giemsa染色1 h，水洗风干后，镜检，并依下式计算白细胞吞噬百分比(phagocytic percentage,PP)和吞噬指数(phagocytic index,PI)。

1.8 免疫保护率的测定

免疫后第28 d，每组各取斑点叉尾鮰20尾，用分离到的病原菌攻毒，病原菌浓度为1.0×108cfu/mL，每尾用量0.2 mL，饲养观察14 d，统计各组的死亡率，采用下式计算免疫保护率(relative percent survival,RPS)[5]。

免疫保护率(%)=(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100

2 结果与分析

2.1 嗜水气单胞菌福尔马林灭活浓度和温度

在嗜水气单胞菌菌悬液中加入不同浓度的福尔马林，并置于不同温度条件下进行灭活，不同浓度和温度的灭活情况见表1。由表1可见，在60 ℃条件下，采用0.4%、0.2%、0.1%浓度的福尔马林分别只需2 h及4 h即可使菌体细胞完全失活；而在28 ℃时，用此3种浓度的福尔马林完全灭活菌体细胞的时间就延长至24 h、48 h和72 h，4 ℃时则分别达到4 d、8 d和8 d以上。从抗原性的保护和灭活效果综合考虑，后续试验中全菌苗的灭活选择了0.2%福尔马林，28 ℃灭活2 d。

表1 不同温度和不同福尔马林浓度对菌细胞的灭活效果Table 1 The detoxication effects of different formalin concentrations and temperatures on bacterial cell

注：+表示菌苗尚具活力，-表示菌苗完全失活。

表2 受免和对照斑点叉尾鮰血清中凝集抗体效价Table 2 Agglutinating antibody titre in the serum of immunized and control Ictalurus punctatus

注：括号中数字为几何平均数。

表3 受免和对照斑点叉尾鮰血液白细胞对F-SA的吞噬活性Table 3 Phagocytic activity of blood leucocytes to formlin killed Staphylococcus aurreus of immunized and control Ictalurus punctatus

注：**表示与对照组差异极显著， *表示与对照组差异显著。

表4 活菌攻毒后斑点叉尾鮰的死亡率和免疫保护率Table 4 Mortality and relative percent survival of the experiment and control Ictalurus punctatus after challenged with live A.hydrophila and A. sobria

2.2 安全性试验结果

注射了灭活全菌苗的30尾斑点叉尾鮰经过15 d饲养，未发现有死亡现象或染病症状，说明所用疫苗的注射剂量对斑点叉尾鮰是安全的。

2.3 凝集抗体效价

用F-1、F-2和F-3分别接种斑点叉尾鮰后28 d后，血清中凝集抗体效价的测定结果如表2所示。由表2可以看出，3株菌苗注射接种斑点叉尾鮰28 d后，受免斑点叉尾鮰血清中凝集抗体效价均不同程度地上升，其中以F-1免疫组最高，平均为1∶60.8；F-2免疫组其次，平均为1∶48.0；凝集抗体效价最低的为F-3免疫组，平均仅为1∶30.4。而对照组血清的凝集抗体效价都很低，平均为1∶6.4。

2.4 血液中白细胞的吞噬活性

由表3可以看出，3株菌苗注射接种斑点叉尾鮰28 d后，受免斑点叉尾鮰血液中白细胞的PP，均极显著地高于对照组(Plt;0.01)，PI也均显著地高于对照组(Plt;0.05)； 其中F-1和F-2免疫组的白细胞的PP和PI极显著地高于对照组(Plt;0.01)。

2.5 免疫保护率

由表4可以看出，斑点叉尾鮰对全菌苗F-1、F-2和F-3分别产生了相应的免疫保护，其免疫保护率分别为52.9%、47.1%和35.3%。

3 讨论

灭活疫苗的制备，关键是确定适宜的灭活剂浓度，灭活温度及灭活时间，这其中使病原菌完全灭活是第一重要的。陈月英等[6]在研究养殖鱼类败血症的嗜水气单胞菌苗时，认为用0.15%～0.2%福尔马林，4 ℃时只需1 d就可使菌细胞灭活。而本研究结果中，菌株Jh-1 4 ℃ 0.2%的福尔马林至少需要8 d才能使其失活。形成以上差异的原因可能是由于菌株之间的个体差异或菌液浓度不同，但本研究结论与杨先乐等[5]认为鳖嗜水气单胞菌4 ℃ 0.2%的福尔马林至少需要12 d才能使鳖嗜水气单胞菌失活的结果较接近。

一般认为，在使致病菌体足以灭活的各种方法中，较温和的灭活条件，即较低的温度与较低的福尔马林浓度(或较短的福尔马林作用时间)，能有效地保护灭活疫苗的免疫性抗原[6]，本试验结果也证实了这一点。但是，杨先乐等[5]认为，并不是所有较低灭活的温度与较低的福尔马林浓度对抗原的损失均较小，这一现象在对草鱼出血病的细胞培养灭活疫苗的研究中也曾出现。因此，在本试验中全菌苗的灭活选择了0.2%福尔马林，28 ℃灭活2 d。但是，灭活条件对灭活疫苗免疫原性的影响是复杂的，只有找出它们之间的相互关系，才能制造出高效价的灭活疫苗，这需要今后进一步研究探索。

硬骨鱼类的吞噬细胞及其构成的单核巨噬系统是鱼类捕捉抗原和清除病原微生物的重要防御系统[7]。一般认为，动物体内的吞噬细胞可吞噬进入体内的异物，在动物体的非特异性免疫中发挥重要作用。白细胞中的颗粒细胞和单核细胞等都与机体的抗感染免疫有密切联系，其中的嗜中性颗粒白细胞和单核细胞等对入侵的病原微生物具有吞噬和杀灭作用，对保持机体生理状态稳定和免疫保护是非常重要的[8]。鱼类的嗜中性白细胞和单核细胞已经被证明具有较强的吞噬能力，这种能力对于特异性免疫机能相对于高等脊椎动物来说比较低下的鱼类而言，具有更为重要的意义。因此，通过测定血液中白细胞的吞噬功能，可以反映机体的非特异性细胞免疫状态[9]。免疫原性是抗原刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的特性。Estevez等[10]报道了通过检测血清凝集抗体效价来评价受免鱼的体液免疫应答水平；陈昌福等[11]通过检测受免鱼的血液白细胞的吞噬活性来评价受免鱼的细胞免疫应答水平。因此，通过检测受免鱼血清凝集抗体效价和血液中白细胞的吞噬活性来考察抗原的免疫原性是合理的。

从本研究结果可以看出，用福尔马林灭活后得到的全菌苗F-1、F-2和F-3，经注射接种斑点叉尾鮰28 d后，受免斑点叉尾鮰血清中凝集抗体效价都有显著增加。对受免和对照斑点叉尾鮰血液白细胞吞噬活性的测定结果表明，3个免疫组的PP和PI都显著地高于对照组。这表明，用福尔马林灭活后得到的全菌苗F-1、F-2和F-3，均能在28 d内刺激斑点叉尾鮰产生较强的体液及细胞免疫应答。

本研究结果显示,对受免斑点叉尾鮰进行活菌攻毒后,斑点叉尾鮰对全菌苗F-1、F-2和F-3分别产生了相应的免疫保护，但免疫保护率均偏低，分别为52.9%、47.1%和35.3%，这可能因为只进行了1 次免疫，如再次免疫，很可能会提高免疫力，这有待于进一步探讨。另外，由于气单胞菌抗原结构比较复杂，全菌苗免疫效果可能会受到限制，而其致病因子的结构相对稳定，因此，可考虑从气单胞菌的致病因子着手，寻找共同的保护性抗原，以研制更有效的疫苗。

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S942.5

A

1673-1409(2009)02-S032-04

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.02.011

2009-06-05

苏应兵(1978-)，男，湖北天门人，农学硕士，助教，主要从事水生动物疾病学研究.