二阶导数光谱法测定非酶褐变反应中抗坏血酸的含量

邓启辉，余爱农

(湖北民族学院 化学与环境工程学院，湖北 恩施 445000)

在食品贮藏与加工的过程中，食品的色泽、香味会发生变化，而引起这些变化的原因可能是食品中发生了非酶褐变(Nonenzymic browning)反应，非酶褐变反应是食品化学中最复杂的反应[1]，产物种类繁多，要使其反应向着有利于色泽、香味生成的方向进行，减少营养价值的损失，增加有益产物的积累，提高食品的品质，就需要对食品贮藏与加工过程中发生非酶褐变反应进行深入的研究.而绝大部分食品都含有抗坏血酸，它对食品贮藏与加工有着重要的影响，因此研究抗坏血酸的非酶褐变反应具有更为重要的意义，抗坏血酸的准确快速测定也就成了进行深入研究的前提.

抗坏血酸的测定方法一般有碘量法[2]，滴定法[3～6]，杂多酸法[7，8]，紫外分光光度法[9～11]，荧光法[12,13].利用导数光谱法对抗坏血酸的含量进行测定也得到了广泛的应用，曾成鸣等[14]对紫外光谱法直接测定抗坏血酸含量进行了研究，何慧等[15]利用一阶导数光度法测定了复方芦丁片中抗坏血酸的含量，张正权等[16]利用二阶及三阶导数光谱法测定了微乳中抗坏血酸的含量，但这些方法在测定产物种类繁多，颜色较深的非酶褐变食品中的抗坏血酸含量时很容易受到颜色的干扰而使得测定结果准确度不高.M.U. Ozgiir等[17]利用双波长三阶导数测定了蔬菜和水果中的抗坏血酸含量，这种方法虽然对非酶褐变食品中的抗坏血酸含量的测定准确度较高，但数据处理较复杂.本文采用偏磷酸溶液作为提取剂[17]，在抗坏血酸—氨基酸体系[18]中探索出一种用单波长二阶导数分光光度法测定非酶褐变反应中的抗坏血酸含量的方法.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

抗坏血酸、偏磷酸、氨基酸(均为分析纯)(国药集团化学试剂有限公司).UV2501紫外分光光度计(日本岛津)；PHSJ-3F型pH计(上海精密科学仪器有限公司)；厚壁耐压反应瓶(北京欣维尔玻璃仪器有限公司).

1.2 方法

1.2.1 溶液的制备 抗坏血酸的标准储备液(0.1 mg/mL)：准确称取抗坏血酸 10.000 0 mg用3%(w/v)偏磷酸溶液溶解，稀释至100 mL；抗坏血酸的标准使用液：吸取储备液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL用3%(w/v)偏磷酸液稀释至10 mL(临时现配)；3%(w/v)偏磷酸储备液：称取15.00 g偏磷酸固体用水溶解，稀释至500 mL；1%(w/v)偏磷酸使用液：称取2.50 g偏磷酸固体用水溶解，稀释至250 mL.2%(w/v)偏磷酸使用液：称取5.00 g偏磷酸固体用水溶解，稀释至250 mL；4%(w/v)偏磷酸使用液：称取10.00 g偏磷酸固体用水溶解，稀释至250 mL.

1.2.2 样品的制备 根据文献[18,19]将L-抗坏血酸0.176 1 g (1.00 mmol,0.001 0 mol) 溶解于10.00 ml 0.2 mol/L pH8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，再用固体NaOH在pH计上调至pH8，装入48 mL P160004厚壁耐压反应瓶中，同时加入0.001 0 mol相应氨基酸，密封，在140℃下搅拌反应2 h，快速冷却，为了使样品中含有微量的抗坏血酸，用截留分子量为500的透析袋透析24 h，将透析后的样品放入4℃的冰箱中备用.

1.2.3 样品测定 取5.00 μL样品，用3%(w/v)偏磷酸溶液稀释至10 mL，摇匀，以相应浓度的偏磷酸溶液作参比，在200～300 nm范围内扫描，记录光谱图和二阶导数光谱图，求出268 nm处的二阶导数值.用偏磷酸溶液代替样品，测定其空白.

2 结果与分析

2.1 导数阶数和波长的确定

用抗坏血酸和半胱氨酸按照1.2.2制备方法制备出样品溶液.标准溶液和样品溶液的零、一、二阶导数光谱图分别见图1、图2和图3，比较二者同阶导数的光谱图发现，样品溶液的二阶导数光谱图与标准溶液的二阶导数光谱图最接近且在268 nm处的吸收最强，所以选定用二阶导数光谱和在268 nm波长下对抗坏血酸进行测定.

图1 零阶导数紫外光谱吸收曲线

图2 一阶导数紫外光谱吸收曲线

图3 二阶导数紫外光谱吸收曲线

2.2 偏磷酸浓度的选择

分别取抗坏血酸的储备液(0.1 mg/mL)400.00 μL，用1%，2%，3%，4%的偏磷酸溶液稀释，定容至10 mL.分别对上述溶液进行光谱扫描，用在268 nm处的二阶导数值和偏磷酸浓度作图，见图4.由图4可见，当偏磷酸的浓度达到3%后，其在268nm处的吸光度的二阶导数值达到最大.

2.3 溶液稳定性的测定

取标准储备液(0.1 mg/mL)400.00 μL用3%(w/v)偏磷酸液稀释至10 mL，每两小时进行一次光谱扫描，对光谱进行二阶导数处理，用其在268 nm下的二价导数值与时间作图,见图5.由图5可见，溶液在常温下能够稳定8 h以上，能够满足测定的需求.

2.4 标准曲线

分别量取0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 mL标准储备液，用3%(w/v)偏磷酸液稀释至10 mL，进行光谱扫描，对光谱进行二阶导数处理，用其在268nm下的二阶导数与其浓度作图，见图6.

图4 偏磷酸浓度对吸光度的影响

图5 时间对溶液稳定性的影响

图6 标准曲线

由结果可见，抗坏血酸含量在1.00～12.00 μg/mL间线性关系良好，经计算处理，回归方程为：

C=6721.304 A-0.058 8，线性相关系数为 γ=0.999 9.

2.5 样品测定和回收率试验

按试验方法，对L-抗坏血酸与半胱氨酸，赖氨酸，精氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸五种氨基酸发生非酶褐变反应后产物中的抗坏血酸含量进行了测定，然后加入定量抗坏血酸标准溶液，进行回收试验，同时计算相对偏差，结果见表1.

表1 样品测定及回收率试验

3 结论

通过测定及回收结果表明，本法的回收率在96.50%～103.75%之间，回收效果良好，说明利用该方法对非酶褐变中的抗坏血酸的测定是可行的，并且结果准确、可靠.

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