香樟愈伤组织的诱导和改良

武 芸

(生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院)，湖北 恩施 445000)

香樟(Cinnamomumcamphora)又名乌樟、芳樟、樟木等，为樟科樟属常绿阔叶乔木，是我国热带、亚热带地区重要的用材、经济和生态树种，为国家二级保护树种[1],主要分布在我国的海南、台湾、福建、江西、广东、广西、湖北、湖南、四川、重庆、云南、贵州、浙江等省市区[2].其木材材质致密，有香气，耐腐防虫，为造船、家具和美术品的上等用材；其树干、树蔸、树根及枝都含有樟油和樟脑，是重要的香料、农药、矿业、国防、化工等原料[3].

香樟在扦插和组织培养方面取得一些进展[4～10].采用种子繁殖，会积累大量变异性状，不利于香樟优良性状的保留.但扦插繁殖受材料和季节限制，且繁殖系数低.利用香樟幼嫩带芽茎段进诱导出了丛生芽，但诱导生根的成功率不高.因此，探索香樟快繁的新途径很有意义.本次研究香樟愈伤组织的诱导和改良，为后续组织培养提供源头和基础，所得优质愈伤可通过器官发生途径得到完整植株；可用于诱导多倍体，改良品种.

1 材料与方法

1.1 材料

香樟幼嫩的茎段来自湖北民族学院校园.

1.2 方法

1.2.1 材料的处理 选取初春香樟萌发的幼嫩茎段作为外植体，用1%的洗洁精浸泡15 min，用小毛刷自下而上顺着涮洗4～5次，清洗掉残留的洗洁精泡沫，自来水冲洗2～3 h后，在超净工作台上用75%的酒精中浸泡30 s左右，用0.1%的氯化汞(升汞)溶液振荡消毒8～10 min(以升汞液面刚好浸没外植体材料为宜)，用无菌水冲洗升汞残留液3～4次，备用.

1.2.2 愈伤组织的诱导 以MS为基本培养基，添加不同浓度的植物生长调节物质，诱导愈伤组织的形成.将已消毒的外植体(保留腋芽的茎段)，切除药液接触过的伤口，剪成约1 cm长的小段，左右，接入到培养基中，使剪切过的横截面伤口，浅浅的埋入到培养基中，以利于培养基中的营养成分和激素等细胞状态调节因子在伤口附近的富集，注意外植体在培养基中的位置分布要均匀，成正多边形，以利于充分利用培养基中营养物质.光照时间12 h/d，光照强度为40 μmol·m-2·s-1，培养温度23～25℃.30d后统计愈伤组织的的形成情况，计算其诱导率，并观察所得愈伤组织的颜色和生长势.诱导率=形成愈伤组织的外植体块数/接种外植体的块数×100%.

1.2.2.1 不同激素及其组合对愈伤组织的诱导效应 以NAA、6-BA、2,4-D和KT不同质量分数为单因子试验，观察它们对香樟的离体茎段的诱导效应；根据单因子试验结果,设置激素组合对愈伤组织诱导及生长的影响.

1.2.2.2 激素、pH和蔗糖质量分数对愈伤组织的诱导效应 采用正交试验的方法，分析激素、pH和蔗糖质量分数对愈伤组织的诱导效应.

1.2.2.3 愈伤组织的改良 通过减少MS基本培养基中硝酸钾的含量，来降低铵态氮和硝态氮之间的比值，达到对愈伤组织进行改良的目的.分别配制减少硝酸钾质量分数的1/6、1/5、1/4、1/3的MS培养基，转接后培养15 d，观察统计.

表1 NAA、6-BA、2,4-D和KT对香樟愈伤组织诱导率

注：-：死亡,+：生长势差，++：生长势一般，+++：生长势较好，++++：生长旺盛，以下同上.

表2 不同激素组合对五鹤续断愈伤组织的诱导效应

2 结果与讨论

2.1 不同植物激素对愈伤组织的诱导

研究NAA、6-BA、2,4-D和KT对香樟愈伤组织诱导的效应，结果表明(见表1)：无论是诱导率还是在生长势，2,4-D和KT比6-BA和NAA都具有更高的诱导活性.在添加2,4-D和KT的培养基中，外植体7d左右可观察到茎段膨胀，切口处有明显的分裂痕迹，而添加6-BA、NAA的培养基15d左右才观察到愈伤组织有萌动的趋势.可见，在单因子试验中，2,4-D和KT适于诱导香樟愈伤组织，其质量分数分别为1.5 mg/L和1.0 mg/L时诱导效率最高，生长势较好.

2.2 不同植物激素组合对愈伤组织的诱导

在单因子试验的基础上,试验了2,4-D+KT、2,4-D+6-BA以及2,4-D+NAA三种组合对愈伤组织诱导及生长的影响.结果显示(见表2)，三种激素组合均可诱导出愈伤组织，2,4-D+KT诱导愈伤组织的效率较高，最高达到了88.7%，因此，诱导愈伤组织的最佳激素组合为2,4-D(1.5 mg/L)+KT(1.0 mg/L).

2.3 激素和蔗糖的质量分数、PH对愈伤组织的诱导效应

研究激素和蔗糖质量分数以及PH对愈伤组织的诱导效应，结果表明(见表3)：根据极差R的大小可知影响香樟愈伤组织的诱导因素中，2,4-D>KT>PH>蔗糖质量分数，2,4-D影响最大，随着2,4-D质量分数增加，愈伤组织的诱导率升高，在质量分数较低的范围内，2,4-D质量分数跟香樟愈伤组织的诱导率呈正相关性；观察表中B列的K值K3

2.4 愈伤组织的改良

试验所得到的部分愈伤组织色泽暗淡枯黄，组织结构膨化疏松，在继续培养的过程中会萎谢，不具备进一步分化生长的能力，通过减少MS基本培养基中硝酸钾的含量，来降低铵态氮和硝态氮之间的比值，达到对愈伤组织进行改良的目的.配制减少硝酸钾质量分数的1/6、1/5、1/4、1/3的MS培养基，转接后培养15 d，观察统计.结果显示，减少硝酸钾1/6、1/5，达不到降低比例的要求，减少1/3，硝酸钾含量偏低，影响愈伤组织的正常生长，减少1/4为最佳，所得的愈伤组织颜色呈淡绿色，质地紧密，生长旺盛，细胞胚性强，可进一步诱导分化.

3 结论

通过激素和蔗糖质量分数以及PH的正交实验，得出诱导香樟离体茎段形成愈伤组织的优化培养基为：MS+2,4-D(1.5 mg/L)+KT(1.0 mg/L)+20 g/L蔗糖,pH为6.0，愈伤组织诱导率可高达89.9%.对所得愈伤组织转入到减少硝酸钾含量1/4的诱导培养基上，其旺盛生长、结构致密，可用于诱导分化.

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