植物生长调节剂对五鹤续断组织培养的影响

张 泽,武 芸

(1.湖北民族学院 附属医院，湖北 恩施 445000；2.生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院)，湖北 恩施 445000)

五鹤续断属于川续断科植物(Dipsacusasper)，其药用部位为干燥根，是川续断中的优质品[1]，具有补肝益肾，续接筋骨，抗骨质疏松，止血安胎等功效，临床上主要用于治疗腰膝酸软，跌打损伤，骨折，腰椎骨质增生，先兆性流产和习惯性流产等症状[2].五鹤续断多糖、总皂甙和总生物碱含量较高[3～5]，其根的热水提取物中存在着抗补体多糖和具免疫调节活性的高分子活性成分[6]，其提取物有促进骨损伤愈合作用的活性成分[7]，续断中的总生物碱能显著抑制子宫平滑肌的自发收缩活动，因此,在临床上可用来治疗先兆性流产和习惯性流产等症状[8].五鹤续断愈伤组织的诱导已有研究[9]，但组织培养的研究国内外均未见报道.本研究用茎尖及多种外植体为材料，旨在解决品种退化问题，保证道地药材的品质并为其扩大种植提供一条有效途径，同时还为进一步采用生物技术进行多倍体诱导作好技术准备.

1 材料和方法

1.1 材料

本实验所用五鹤续断均来自生物资源保护与利用重点实验室(湖北民族学院)植物培养室.

1.2 方法

1.2.1 外植体处理 挑选健壮的五鹤续断植株，取其茎尖、幼嫩的茎和叶作为外植体，用洗洁精清洗干净后，流水冲洗2 h，用滤纸吸去多余的水分，在超净工作台上用75%的酒精中消毒30 s左右，用无菌水冲洗3遍，再转入0.1%的升汞溶液中振荡消毒：茎尖6 min、茎8 min、叶6 min，无菌水冲洗3次，然后置于无菌培养皿中，切除药液接触过的伤口并剥去茎的外表皮，切成0.5 cm长的小段，叶切成0.5 cm见方的正方形，接种于附加不同植物生长调节物质及其组合的MS培养基上培养.所有MS培养基中均添加6.0 g/L琼脂和20 g/L蔗糖，pH在灭菌前调至6.0～6.1.培养条件均为温度23～25℃、光照强度40 μmol·m-2·s-1、光照时间12 h/d.

1.2.2 初代培养 接种外植体的MS培养基，附加不同植物生长调节物质及其组合，研究其对外植体愈伤组织的诱导效应，从而筛选出诱导愈伤组织的最佳培养基.每个处理接种10瓶，每瓶接种4块外植体，30 d后计算出愈伤组织块数和诱导率[3].诱导率=形成愈伤组织的外植体块数/接种外植体的块数×100%.

1.2.3 丛生芽诱导 用NAA(0.1、0.3、0.5、0.7、1.0)mg/L和6-BA(1.0、1.5、2.0)mg/L的不同配比，添加到MS基本培养基中，诱导丛生芽的产生.每个处理接种40块生长比较一致的愈伤组织，培养30 d后测定平均出芽数[10].

注：-：死亡,+：生长势差，++：生长势一般，+++：生长势较好，++++：生长旺盛，以下同上.

图1 五鹤续断愈伤组织的增殖曲线

1.2.4 生根培养 将高2 cm左右的芽苗剪下，转入到1/2MS生根培养基中培养，培养基中附加激素(NAA和多效唑)、6.0 g/L琼脂和20 g/L蔗糖，pH5.8.每个处理接种30根芽苗，30 d后测定平均生根数.

2 结果与讨论

2.1 不同植物生长调节物质组合的诱导效应

将外植体接种到NAA+6-BA和2,4-D+6-BA两种组合的MS培养基中进行初代培养，结果表明(见表1)，MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.1 mg/L和MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L的愈伤诱导效果较好，其诱导率分别达到了92.5%和91.7%，但愈伤组织在色泽、质地和生长势方面均表现不同，前者所得愈伤组织呈深绿色、质地较好，生长较快，适合于快速繁殖；后者诱导的愈伤呈黄绿色，质地较硬，不利于快繁.因此，MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L为初代培养的最佳培养基.

2.2 不同外植体的诱导效应

不同类型外植体诱导愈伤组织的效果不同：茎尖、幼嫩的茎段和叶作为外植体都能诱导出愈伤组织，其诱导率分别为76.67%、83.33%和40.00%，其中以茎尖和幼嫩的茎段诱导愈伤率较高，生长势好；叶诱导愈伤率较低，愈伤呈黄色泡状，继代后死掉了，不适于用作快繁的外植体.茎尖培育的幼苗可达到脱毒效果，能有效防止品种退化，因此，茎尖是较理想的外植体.

2.3 光照的影响

用诱导愈伤组织的最优培养基MS+6-BA1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L进行继代培养.每瓶接种鲜重1 g且色泽一致的愈伤组织，一部分置于光强为40 μmol·m-2·s-1，12 h/d，温度为25℃左右条件下培养；另一部分置于暗培养箱中对照培养.每3 d取两种条件下培养的愈伤组织称重，计算愈伤组织的鲜重，并重复3次，取其平均值，其结果如图1所示.

研究结果显示，其愈伤组织的生长可明显地分为3个时期：延迟生长期(0～9 d)、指数生长期(9～24 d)和静止(24～30 d)期.愈伤组织在延迟期生长缓慢，在指数生长期愈伤组织鲜重急剧增加，在静止期愈伤组织鲜重增加几乎停止，由此可见愈伤组织在光照下长势好，并且愈伤组织的颜色呈深绿色,结构较疏松；在暗培养中愈伤组织呈黄白色，长势较慢.

2.4 丛生芽诱导

用生长较一致的绿色愈伤组织为材料，用6-BA和NAA的不同质量分数诱导丛生芽产生，结果表明(见表2)，培养基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L诱导丛生芽个数最高，芽苗生长健壮，因此，MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L为诱导丛生芽的最优培养基.

表2 不同激素配比诱导丛生芽的效果(质量分数均为mg/L)

表3 不同激素配比诱导生根的效果(质量分数均为mg/L)

2.5 生根培养

用IBA和多效唑(PP333)的不同质量分数来诱导五鹤续断生根，结果表明(见表3)：单独使用IBA时可以诱导生根，以质量分数为0.4 mg/L时最佳；在培养基中添加多效唑(PP333)后可促进生根，使生根数大大增加，综合考虑因素IBA和PP333的影响，诱导生根的最佳培养基为1/2MS+IBA 0.4 mg/L+PP3330.4 mg/L.

2.5 炼苗与移栽

将生根后的芽苗长到高5～6 cm、根长约3 cm时开始炼苗.先打开培养瓶盖，置于室温散射光下，补加适当的蒸馏水进行炼苗.炼苗3～4 d后取出试管苗，洗去根部培养基，移栽入装有灭过菌的草炭+蛭石(2∶1)的花盆中，并适时浇以霍格兰营养液，放入温室中培养，湿度保持90%左右，三周后移栽.移栽后每天至少两次喷洒适量水(土润湿为止)，移栽后的小苗注意保湿、遮荫和适当通风，小苗成活率可达85%以上.

3 结论

在五鹤续断组织培养过程中，以茎尖为外植体可避免内生菌的产生，是较理想的实验材料.茎尖产生的愈伤组织分化较好，是防止品种退化的最有效途径.本研究确定了五鹤续断组织培养的最佳培养基为：

1)初代培养基MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L；

2)丛生芽诱导培养基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L；

3)生根培养基1/2MS+IBA 0.4 mg/L+PP3330.4 mg/L.

[1]武芸,丁莉,周吉源.五鹤续断的研究概况与开发前景[J].湖北民族学院学报:医学报,2004,21(4):31-33.

[2]全国中草药汇编写组.全国中草药汇编(下册)[M].北京:人民卫生出版社,2000：135-136.

[3]武芸.五鹤续断多糖的提取及动态分布规律的研究[J].时珍国医国药,2009,20(6)：1 325-1 326.

[4]武芸.五鹤续断中总皂甙提取工艺优化[J].时珍国医国药,2008,19(4)：826-827.

[5]武芸.五鹤续断中总生物碱提取分离工艺的初探[J].时珍国医国药,2008,19(2)：708-709.

[6]严忠红.川续断根部免疫调节多糖的分离和化学性质[J].植物学分册,1998,13(3):122-123.

[7]纪顺心,吴雪琴,李崇芳.中药续断对大鼠实验性骨损伤愈合作用的观察[J].中草药,1997,28(2):98-99.

[8]龚晓健,季晖,王青,等.川续断总生物碱对妊娠大鼠子宫的抗致痉及抗流产作用[J].中国药科大学学报,1997,29(6):459-461.

[9]武芸,丁莉,韩鸿，等.五鹤续断愈伤组织的诱导和增殖[J].安徽农业科学,2009,37(13):5 877-5 878.

[10]武芸,郑小江,武玉莲，等.恩五叶蜜甜味绞股蓝快反体系的建立与优化[J].湖北农业科学,2010,49(1)：27-30.