丹龙腰痛颗粒提取纯化工艺研究

龙玉堂，夏新华*，雷 杨，陈 希

（湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208）

丹龙腰痛颗粒提取纯化工艺研究

龙玉堂，夏新华*，雷 杨，陈 希

（湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208）

目的 研究丹龙腰痛颗粒的最佳提取纯化工艺条件。方法 以浸膏得率和丹酚酸B浸出量为指标，对丹龙腰痛颗粒提取纯化的工艺条件进行优选。结果 确定丹参等水提的最佳工艺为：丹参等饮片浸泡1.5 h，回流提取2次，加水量分别为10、8倍量，提取时间分别为1.5、1.0 h，提取液浓缩至相对密度1.20，加乙醇使药液含醇量达60%。结论 该工艺经中试实验，表明稳定可行。

丹龙腰痛颗粒；提取纯化工艺；正交试验；丹酚酸B；高效液相色谱法

丹龙腰痛颗粒由丹参、地龙、牛膝、杜仲、狗脊等10味药组成，具有活血通络，宣痹止痛，补肾强腰的功能。丹参为该制剂的君药，所含有效成分包括脂溶性药有效成分（如丹参酮ⅡA）与水溶性有效成分（如丹酚酸B、丹参素）二类。但随着丹参研究的深入，人们发现丹参中的水溶性成分在药理作用上比脂溶性成分要强，丹酚酸B和丹参素是其中的主要水溶性药效成分，而丹参素的含量远远低于丹酚酸B。丹酚酸B具有改善肾功能、防治心血管疾病、清除羟自由基、抗缺血损伤、抗凝血、抗血栓、抗炎、肝损伤保护及促进纤维蛋白溶解等作用[1-3]。因此，本文以丹酚酸B转移率为主要的评价指标，对该制剂的提取纯化工艺进行了研究。

1 实验材料

1.1 仪器

岛津LC-10AT高效液相色谱仪、SPD-10A紫外检测器（日本岛津仪器有限公司）；AY120 Shimadzu电子分析天平（日本岛津仪器有限公司）；RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-3循环水多用真空泵（郑州杜甫仪器厂）；DK-S22型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；DZF-6020真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；SK3300H 超声仪（HENGAO T＆D）。

1.2 试药

丹酚酸B对照品 批号：111562-200807，供含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供；丹参等饮片购自长沙市佰佳中药饮片公司，经湖南中医药大学中药鉴定与生药学教研室刘塔斯教授鉴定为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎；甲醇、乙腈为色谱纯，甲酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 丹酚酸B含量测定

2.1.1 色谱条件 Apollo C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇∶乙腈∶甲酸∶水（30∶10∶1∶59）为流动相；检测波长为286 nm；柱温为30℃；流速:1.0 mL/min。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品11.0 mg，置入10 mL的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取0.73 mL置入10 mL的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（0.080 3 mg/mL）。

2.1.3 标准曲线的绘制 精密吸取浓度为0.080 3 mg/mL的丹酚酸 B 对照品溶液 2、4、6、8、10 μL，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，进样量为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程：

表明丹酚酸B在0.160 6～0.803 μg范围内具有良好的线性关系。

2.1.4 供试品溶液的制备与测定 精密量取水提液5 mL于25 mL的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀,过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，作为供试品溶液。精密吸取对照品溶液与供试品溶液适量，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2 水提次数的考察

称取丹参、地龙、牛膝等饮片适量，回流提取3次，加水量分别为8、6、6倍量，提取时间均为1.5 h，分别收集各次提取液，定容至1 000 mL，依法测定浸膏得率和丹酚酸B转移率。由表1可以算出，第3次提取丹酚酸B的转移率仅占3次总量的8.5%，故提取2次即可。结果见表1。

表1 提取次数对浸出的影响（%）

2.3 丹参等提取工艺的优选

2.3.1 试验设计[4]在提取次数考察的基础上，采用正交试验法对丹参、地龙、牛膝等提取的其它工艺条件进行优选。选择浸泡时间（A）、加水量（B）、提取时间（C）作为考察因素，以浸膏得率及丹酚酸B提取转移率为评价指标，用L9（34）正交表安排试验。所选因素水平及正交试验方案见表2～3。

表2 醇提工艺正交试验因素水平表

2.3.2 实验方法与结果 依处方比例称取丹参等饮片适量,共9份，照表2的安排，分别回流提取2次，收集提取液，滤过，定容至1 000 mL。依法测定浸膏得率与丹酚酸B含量，结果见表3。

2.3.3 数据处理与分析 对表3试验结果进行数据处理，以浸膏得率为指标，方差分析表明A、B、C 3因素对浸膏得率均无显著性影响（见表4）。以丹酚酸B转移率为指标，方差分析（见表5）显示B因素（加水量）对浸出有显著性影响，根据直观分析,B因素取B3为佳；A、C 2因素对浸出的影响不明显，可任取一水平，从降低生产成本、减少能耗等角度综合考虑，分别选取A3与C2。综上可确定提取工艺的最优条件为A3B3C2，即提取时浸泡1.5 h，提取2次，加水量分别为饮片的10、8倍量，提取时间分别为1.5、1.0 h。这一方案与正交表中丹酚酸B转移率最高的第9号试验方案一致，表明所选提取工艺条件合理可行。

表4 水提浸膏得率方差分析表

表5 丹酚酸B转移率方差分析表

2.4 纯化工艺的研究

2.4.1 药液浓缩程度的考察 称取丹参、地龙、牛膝等饮片适量,按上述优选的工艺进行提取，收集提取液，浓缩至适量。取等体积浓缩液3份，分别进一步浓缩至相对密度为1.20、1.17、1.11（60℃热测），加乙醇至含量达60%，静置24 h，滤过，残渣用60%乙醇冲洗，分别定容至1 000 mL，依法测定浸膏得率与丹酚酸B转移率。结果表明，药液浓缩至相对密度为1.11～1.20（60℃），醇沉后丹酚酸B转移率与浸膏得率差别不大，但从减少乙醇消耗量来考虑，则以相对密度1.20为佳（见表6）。

表6 药液浓缩程度对醇沉的影响（%）

2.4.2 药液含醇量的考察 取丹参、地龙、牛膝等饮片的提取液，浓缩至相对密度为1.20（60℃热测）。取等体积浓缩液3份，分别加乙醇至含量达50%，60%，70%。静置24 h，过滤，残渣分别用同浓度的乙醇冲洗，分别定容至1 000 mL，依法测定浸膏得率与丹酚酸B转移率。结果表明，醇沉药液含醇量达60%时，丹酚酸B具有较高的转移率（见表7）。

表7 药液含醇量对醇沉的影响（%）

3 结论

根据上述实验研究，可确定丹龙腰痛颗粒提取纯化的最佳工艺条件为：取丹参等饮片，加水浸泡1.5 h，提取2次，加水量分别为10、8倍量，提取时间分别为1.5、1.0 h；醇沉时，药液浓缩至相对密度为1.20（60℃热测），加乙醇至药液含醇量达60%。该工艺经中试生产，表明稳定可行，故适合工业化生产。

该制剂中丹参所含水溶性有效成分丹酚酸B的热稳定性较差，故对提取液采取减压低温浓缩。另外，醇沉时控制药液的相对密度为1.20（60℃），而未进一步提高药液的浓缩程度，亦是为了减少药液的受热时间，以尽量避免丹酚酸B等有效成分的破坏；同时，浓缩程度过大，药液黏稠度过高，醇沉时有效成分分散较慢，易被快速析出的杂质包裹而损失。

[1]杜冠华,张均田.丹参水溶性有效成分-丹酚酸研究进展[J].基础医学与临床,2000,20(5):394-398.

[2]薛春生,王浴生,邓文龙.中药药理与应用[M].北京:人民卫生出版社,2000:190.

[3]湛月娥,孙莉莎,程玉芳,等.丹酚酸B对犬心肌耗氧量的影响[J].实用医学杂志,2006,22(9):1 001.

[4]叶 勇，谭汉梯，江 帅.正交试验法优选丹参中丹酚酸B的提取工艺[J].湖南中医药大学学报，2006，26（6）：22-23.

Optimum extraction and purification conditions of Danlong Yaotong granules

LONG Yu-tang，XIA Xin-hua，LEI Yang，CHEN Xi(TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo study the optimum conditions of extraction and purification of Danlong Yaotong granules.MethodsThe extraction and purification conditions were optimized with the extract yield and the amount of the extracted Salvianolic acid B as indexes.Result The optimal extract condition of Salviae Miltiorrhizae was as follows:soaking 1.5 hours in water,extracting two times,and the water was 10 and 8 times respectively,the extraction time were 1.5and 1.0 hours respectively,the relative density of the liquid was 1.20 and 60%if the alcohol was added in it.ConclusionThe extraction process is stable,feasible and suitable for industrial production.

Danlong Yaotong granules；extraction and purification process；orthogonal test；salvianolic acid B;HPLC

R283.6

B

10.3969/j.issn.1674－070X.2010.11.012.037.03

2010－04－20

龙玉堂（1983-），男，湖南衡阳人，硕士研究生,主要从事中药新制剂工艺与质量标准的研究。

* 夏新华，男，教授，博士研究生导师，E-mail：xiaxinhua001@163.com。

（本文编辑 徐爱良）