基于体外药效实验的全蝎提取工艺研究

许文博， 王玉蓉*， 黄能听， 赵韶华， 张玉杰

(1.北京中医药大学，北京100102;2.河北以岭医药集团，河北石家庄050035)

全蝎(Buthus martensii Karsch)系钳蝎科节肢动物干燥物，性平，味辛，有毒，归肝经。具有通络止痛、熄风止痉作用。现代药理实验表明全蝎提取液具有抗凝和抗血栓等作用［1－2］。为进一步研究全蝎的抗凝活性部分的工艺［3］，本实验以APTT法、纤维蛋白原平板法为考察指标，对仿生酶解法、复合酶解法、水提醇沉法、生理盐水浸提法等提取方法的效果进行比较，以证明仿生酶解法工艺的可行性。

1 材料

1.1 药材

全蝎为全虫干燥体，由河北以岭药业集团提供，经本校陈玉婷教授鉴定系钳蝎科动物东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)的干燥体，置于60℃干燥箱干燥，粉碎成细粉，备用。

1.2 试剂

牛血清白蛋白(BSA，Sigma A7906，北京环亚泰克生物医学技术有限公司);牛纤维蛋白原(Sigma F8630，北京环亚泰克生物医学技术有限公司);胰蛋白酶1∶250(Amresco0458，北京华美转导科技有限公司);胃蛋白酶1∶10 000(Sigma P7000，北京环亚泰克生物医学技术有限公司);医用注射性尿激酶(北京市望京医院);凝血酶(Sigma T4648，北京环亚泰克生物医学技术有限公司);APTT试剂10×1.5 mL(上海太阳生物试剂公司);Protein Assay Dye Rgnt(Bio－red 5000006;北京泽平科技有限责任公司);三氯乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);乙醇(分析纯)。

生理盐水(称取氯化钠9 g，加蒸馏水定容至1000 mL，摇匀，即得);人工胃液(取盐酸9 mL，加蒸馏水稀释成1000 mL，即得);人工肠液(取0.2 mol/L磷酸二氢钾溶液250 mL，加0.2 mol/L氢氧化钠溶液118 mL，用水稀释至1000 mL，摇匀，即得)。

1.3 动物

健康日本大耳白兔(♂性)，体重约2 kg(北京维通利华实验动物技术有限公司提供，符合国家健康一级动物标准，动物许可证编号为:SCXK(京)2006－0009。

1.4 仪器

UV－2000型分光光度计;800B型离心机(上海安亭科学仪器厂);ES－120型电子分析天平(长沙湘平科技发展有限公司);恒温水浴锅(余姚市东方电工仪器厂);DZ－1BC型真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。

2 方法

2.1 仿生酶解法

在采用紫外分光光度法研究酶解工艺基础上［4］，继以蛋白质水解度为指标，单因素考察全蝎仿生酶解的工艺条件。

2.1.1 蛋白质浓度的测定［5］

2.1.1.1 试剂的配制 染色液的配制:准确量取Bio－Rad Protein Assay 50 mL，加入蒸馏水稀释定容至250 mL，滤去不溶性物质即得，置室温下可保存6个月。

牛血清白蛋白(BSA)1 mg/mL的配制:准确称取10 mg BSA，蒸馏水定容于10 mL，其浓度为1 mg/mL(1 000 mg/L)，置冰箱保存。

2.1.1.2 标准曲线的制备 以1 mg/mL BSA为母液给各个试管分别加入 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL，用蒸馏水补充至0.1 mL，以上每种浓度平行操作两份，最后各试管中分别加入5.0 mL考马斯亮兰G－250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合。2 min至1 h之内(室温下)于波长595 nm处测定各管吸光度值A595nm，两个平行样品取其平均值。空白对照为0.1 mL蒸馏水加5 mLG－250试剂。以吸光度值A595nm为纵坐标，以标准蛋白浓度BSA为横坐标，作图即绘出测定蛋白质浓度的标准曲线。得线性方程y=0.994 7x+0.023 8(r=0.998 6)。结果表明，BSA在0～1 mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.1.3 供试品的制备方法 取2 g全蝎药材细粉于50 mL具塞圆底烧瓶中，加入40 mL人工胃液，密闭，于37℃恒温水浴作用30 min后，加入一定量胃蛋白酶水解一定时间后，将酶解液置于85℃恒温水浴作用15 min，得样品1，沉淀备用;取200 μL的样品1和等体积的质量分数为20%的TCA溶液，冷却至室温，以4 000 r/min离心15 min，取上清液，为样品2;上述备用沉淀于50 mL具塞圆底烧瓶中，继加入20倍量人工肠液，密闭，于适宜恒温水浴作用30 min后，加入若干胰蛋白酶水解一定时间，将酶解液于85℃恒温水浴作用15 min，得样品3;与样品2同法制得样品4。

2.1.1.4 水解度的计算方法［6］

式中:N2为药材酶解液加入20%TCA后测得的可溶性蛋白量(g/L)，即样品2及样品4;N1为药材酶解前加入20%TCA测得的可溶性蛋白量(g/L)—1 g药材细粉加入10 mL 20%TCA，过滤，所得上清液;N0为不同酶解工艺提取总蛋白量(g/L)，即样品1或样品3。

经筛选确定全蝎的最优酶解工艺为:全蝎药材细粉加入人工胃液(固液比1∶20)，密闭，于37℃恒温水浴作用30 min后，加入3.0%胃蛋白酶水解3 h，将酶解液置于85℃恒温水浴作用15 min，冷却至室温，以4 200 r/min离心15 min，取上清液，干燥得全蝎胃蛋白酶酶解物;沉淀干燥，继加入20倍量人工肠液，密闭，于37℃恒温水浴作用30 min后，加入5%胰蛋白酶水解4 h，将酶解液于85℃恒温水浴作用15 min，冷却至室温，以4 200 r/min离心15 min，取上清液，干燥得全蝎胰蛋白酶酶解物。

2.2 水提醇沉法［7］

称取2 g全蝎药材细粉于50 mL圆底烧瓶，加入8倍量蒸馏水，煎煮1 h，纱布滤出煎煮液;药渣再加6倍量蒸馏水，煎煮2次，每次30 min，合并3次滤出液，水浴浓缩至药液比为1∶1，搅拌加入95%乙醇至含醇量为70%，置冰箱中放置过夜后4 200 r/min离心20 min，取上清液挥干，60℃真空干燥称重，得全蝎水提醇沉物。

2.3 生理盐水浸提法

称取2 g全蝎药材细粉于50 mL圆底烧瓶，加入40 mL生理盐水，于37℃恒温水浴锅浸提4 h，4 200 r/min离心15 min，取上清液，60℃真空干燥称重，得全蝎生理盐水浸提物。

2.4 复合酶解法［7］

称取2 g全蝎药材细粉于50 mL圆底烧瓶，加入40 mL人工胃液，密闭，于37℃水浴作用30 min后，加入60 mg胃蛋白酶水解，3 h后用1 mol/mL NaOH溶液调节酶解液的pH=6.8，加入100 mg胰蛋白酶酶解4 h，于85℃水浴灭酶15 min，4 200 r/min离心15 min，取上清液，60℃真空干燥称重，得干燥复合酶解物。

3 实验结果

3.1 样品液的制备

精密称取各种提取方法所得提取物适量，加入320 μL生理盐水，制成浓度为250 mg(生药量)/320 μL的样品(即0.781 3 mg/μL)。

3.2 APTT 法［8］

3.2.1 血浆的制备 选用♂性日本大耳白兔，耳缘静脉注射戊巴比妥钠麻醉，颈动脉取血，加入3.8%枸橼酸钠抗凝(1∶9)，混匀后以3 000 r/min，离心 15 min，取上清液，分离出贫血小板血浆(PPP)。

3.2.2 测定步骤 在测试槽中，将已预温10 min的APTT试剂100 μL，与预温5 min的待测血浆(100 μL PPP 加样品液10 μL)混合，孵育5 min后加入预温37℃的 CaCl2100 μL，同时计时，用针尖拨动溶液，当有丝状凝结物被针挑起时，记录时间。

空白对照组:按上述方法取 PPP 100 μL，加入10 μL生理盐水和100 μL APTT试剂，孵育5 min后加入预温37℃的CaCl2100 μL，同时计时，记录凝结时间。每个样品平行做6份。结果见表1。图1。

表1 全蝎4种提取方法APTT抗凝药效考察(±s，n=6)

表1 全蝎4种提取方法APTT抗凝药效考察(±s，n=6)

与生理盐水组比较，*P＜0.05。

/s水提醇沉组样品名称 浓度/(mg/μL) 凝血时间0.781 3 35.62±3.55生理盐水浸提 0.781 3 46.92±5.13*复合酶解组 0.781 3 46.08±2.17*仿生酶解胃酶酶解部分 0.781 3 ＞300.00*仿生酶解胃酶酶解部分(低浓度) 0.390 6 70.02±5.06*仿生酶解组胰酶酶解部分 0.781 3 95.73±7.05*生理盐水组 0 25.52±1.09人工胃液组0 31.70±1.07

通过全蝎4种提取物的抗凝实验效果比较，结果表明酶解组优于传统溶剂提取组，其中仿生酶解组抗凝效果最优，证明仿生酶解法基本可行，见图1。

图1 全蝎4种提取方法APTT抗凝药效考察

3.3 纤维蛋白原平板法［9］

纤维蛋白原在凝血酶加入后形成了凝固的纤维蛋白平板。当加入含有纤溶酶原激活剂的样品后，纤溶酶原激活剂激活平板中的纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶再水解纤维蛋白。从而在凝固的纤维蛋白中形成液状的溶解圈。另外，尚存有不依赖纤溶酶系统的纤溶作用。如木瓜蛋白酶、糜蛋白酶等可不通过激活纤溶酶而降解纤维蛋白(原)。

3.3.1 试液的配制 磷酸缓冲液(PBS):称取3.12 g磷酸二氢钠，加蒸馏水定容到100 mL，即得A液;称取磷酸氢二钠7.163 2 g，加蒸馏水定容到100 mL，即得B液;使用时，取A 液760 μL、B 液3 240 μL加入76 mL生理盐水，即得磷酸缓冲液。

纤维蛋白原溶液:称取纤维蛋白原0.3 g加入60 mL PBS，振摇，溶解，即得。

3.3.2 纤维蛋白平板的制备 在平皿内加入9 mL 5 g/L的纤维蛋白原溶液，再加入2×103U/L的凝血酶溶液1 mL，立即打旋混匀大约10 s，即形成1 mm厚的纤维蛋白凝块，在平皿上盖加滤纸，在水平处放4 h后即形成纤维蛋白平板。

3.3.3 测定步骤 将样品液、尿激酶(6×105U/L)和生理盐水各10 μL分别点在纤维蛋白平板上，各点间距大于1.5 cm。置纤维蛋白平板于湿盒内，放入37℃烘箱中，4 h后观察有无溶解圈，并测量溶解圈的直径，计算溶解圈面积，以溶解圈面积大小衡量纤溶活性的大小。见表2和图2。

溶解圈面积(mm2)=［(长径+短径)/4］2×π。

表2 全蝎各种提取方法纤维蛋白平板溶栓实验结果(n=4)

图2 全蝎提取方法的药效考察

从图2可以看出，全蝎酶解法优于传统提取方法，其中仿生酶解法所得的胃酶酶解部分和胰酶酶解部分有明显溶解圈，进一步证明仿生酶解法可行。

4 小结与讨论

4.1 APTT试验结果表明

全蝎的各种提取方法所得提取物均能在一定程度上延长APTT凝血时间，其中仿生酶解法胃酶酶解部分和胰酶酶解部分APTT凝血时间最长，故认为仿生酶解法基本可行。

4.2 纤维蛋白原平板试验结果表明

仿生酶解法所得的胃酶酶解部分和胰酶酶解部分较其他提取物的溶解圈明显增大，进一步证明仿生酶解的工艺方案可行。推测其原因是:仿生酶解法模拟了动物药口服后体内消化过程，将动物体大分子蛋白经胃肠环境降解为小分子物质，使有效部分显露其活性效应。胃酶酶解原液部分还有活性，表明用胰蛋白酶进一步酶解的必要性。

4.3 原文献中，纤维蛋白原平板实验的溶解圈长短径多以钢尺或游标卡尺粗量，量化不十分准确。本实验采用1000万长焦数码相机拍照，辅以作图工具ipwin32测量，通过设立标尺，以相对值进行计算，提高了精确度。

4.4 本研究为全蝎采用仿生酶解后分离纯化抗凝、抗血栓的活性部分奠定了基础。

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