鸡Toll样受体的研究进展

韩小凤,张辉华,谢青梅,马静云,毕英佐

(1.华南农业大学动物科学院,广东 广州 510642;2.佛山科学技术学院生命科学院,广东 佛山 528231)

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一种天然免疫分子,它通过识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)在其宿主有机体的天然免疫系统中起着重要的防御作用[1]。它的结构包括以下3个部分：胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区富含亮氨酸重复序列(leuine-rich repeats,LRRs),跨膜区富含半胱氨酸,胞内区有一个高度保守的蛋白相互作用区,与IL-1R(哺乳类白介素-1受体)胞内结构区相似,称为 Toll-IL-1R(TIR)功能域,亦称为Toll同源结构域(tollhomolo gydomain,THdomain),参与TLR的信号传导[2]。目前研究表明,Toll样受体家族成员具有不同的配体,表达方式也可能存在差异。它们识别不同的病原微生物组分,例如：脂蛋白、肽聚糖、双链病毒RNA、LPS、咪唑喹啉(imidazoquinolines)、未甲基化细菌CpG-DNA等[3]。TLRs在激活免疫系统尤其是天然免疫系统中起着至关重要的作用。

至今,在哺乳动物尤其是在人类和小鼠的细胞中,已发现13种TLRs[4],但禽类TLRs的研究才刚刚起步。Yilmaz A[5]等利用生物信息学中基因预测原理和ESTs数据信息,预测和鉴定出鸡的TLRs同系物,分别称为：ChTLR1LA,ChTLR1LB,ChTLR2A,ChTLR2B,ChTLR3,ChTLR4,ChTLR5,ChTLR7,之后不同实验室在研究中又陆续发现了ChTLR15、ChTLR16、ChTLR21。与哺乳动物 相比,所有ChTLRs都含有与其相同的蛋白二级结构,包括若干富亮氨酸域,一个跨膜域和 IL-1R。本文就鸡Toll样受体的最新研究进展进行简要综述,主要包括鸡Toll样受体的基因结构特点、功能特点及其细胞内的信号转导机制等方面内容,为鸡抗病药物的开发和疾病的治疗提供理论基础。

1 ChTLRs的基因定位与基因结构

基因组序列分析证明,Ch TLRs所处的染色体位置是比较保守的。ChTLR1LA和Ch TLR1LB的基因相连,定位于 4号染色体[1]。ChTLR2A和ChTLR2B也存在相同情况。Boyd Y等[6]进一步发现Ch TLR3基因定位于4号染色体,而ChTLR2更确切地是定位于 4号染色体 p11-q11区域。ChTLR2与ChTLR3相比,长度大约少了4 100万个核苷酸。作为人类的直系同源物,ChTLR4,ChTLR5和ChTLR7则不相连,分别定位于17、3号染色体和1号染色体。其中Ch TLR4准确定位于小染色体E41W17区域,这个区域被证明与抗沙门菌感染有关[7]。另外,Nicholas D T等[1]最新证明Ch TLR15定位于3号染色体,ChTLR21定位于11号染色体。准确掌握Ch TLRs的基因定位及结构特点,将为进一步研究Ch TLRs相关机理提供一个新的切入点。

2 ChTLRs的几种主要成员及功能

2.1 ChTLR3 Ch TLR3编码一个含有896个氨基酸的蛋白,它能专一的识别双链RNA(dsRNA),dsRNA是一种与病毒感染相关的分子,大部分病毒在复制的过程中产生dsRNA。此外,ChTLR3也能识别poly(I∶C)(一种dsRNA模拟物,具有病毒dsRNA相似的功能)。TLR3通过依赖My D88信号通路和非依赖My D88信号通路都能最终激活细胞内的信号传导,诱导NF-κB活化和各种细胞因子的表达,调节机体细胞先天性免疫反应。TLR3在病毒感染中起着重要的作用,它可以诱导干扰素(IFNs)和多种抗病毒效应分子的产生。poly(I∶C)刺激鸡的白细胞后,会诱导I型IFN和TLR3表达量的增加,同时Ⅰ型IFN也会刺激 TLR3的表达。Adam J等[8]用高致病性禽流感(H 5N1)病毒感染鸡,结果发现在鸡的大脑、脾和肺组织中 TLR3和IFN表达上调。施蕾[4]通过用IBDV感染CEF,研究相关 TLR对 IBDV感染力的影响,结果发现TLR3在病毒感染24 h后表达水平有明显增高,从转录水平上证明了TLR3对IBDV感染有作用。同时试验还发现TLR3基因的沉默可影响IBDV的复制及成熟病毒的释放,从翻译水平上证实了 TLR3在IBDV的感染中起了重要的作用。

2.2 ChTLR4 Ch TLR4编码一个含有843个氨基酸的蛋白,ChTLR4蛋白和人TLR4蛋白相比,有46%的同源性。Leveque G等[7]通过试验发现TLR4在鸡组织中的表达水平大致相同,包括大脑、胸腺、肾脏、肠、肌肉、肝脏、肺、腔上囊,心脏和脾脏。利用连锁分析可知,TLR4可以抵抗肠沙门菌对鸡的感染,在鸡的抗沙门菌宿主免疫中起着重要的作用。Jessica R等[9]最新研究发现,用肠炎沙门菌分别刺激抗性鸡群和易感鸡群,两组鸡的异嗜白细胞TLR4 mRNA表达量有上调的趋势,说明家禽对沙门菌的易感性确实与Ch TLR4有关。

2.3 ChTLR5 ChTLR5全基因长为2 589 bp,编码一个含有862个氨基酸的蛋白。目前,Marijke K等[10]已克隆出鸡TLR5的基因,并成功地把它表达到HeLa细胞中。他们用肠炎沙门菌感染ChTLR5转染细胞可引起NF-κB的活化。ChTLR5可以识别肠炎沙门菌鞭毛蛋白并对其产生免疫应答。同时研究也发现替换细菌鞭毛蛋白中单一的氨基酸可以改变TLR5的特殊应答性,从而影响宿主感染的敏感度及范围。无鞭毛的肠炎沙门菌会引起家禽产生系统性疾病,而有鞭毛的肠炎沙门菌则不会。鞭毛蛋白会导致鸡对肠炎沙门菌的固有免疫应答作用增强,表明Ch TLR5在细菌感染过程中起着非常重要的作用。

2.4 ChTLR7 ChTLR7定位在1号染色体lq14-lq31,ChTLR7基因编码1 059个氨基酸,包含2个外显子。ChTLR7识别病毒单链RNA,这种识别会诱导促炎细胞因子例如IL-1β和IL-6以及抗病毒细胞因子例如IFNs的产生。弓莉[11]以鸡传染性囊病病毒感染鸡为模型,应用RT-PCR方法对90只11日龄岭南黄肉鸡 TLR7 mRNA进行半定量检测。通过区组试验对比得知脾脏组织中TLR7 mRNA表达强度和升高幅度比腔上囊组织中的大。试验结果表明,腔上囊病毒感染过程中TLR7 mRNA表达存在明显的组织差异。Sean C A[12]等通过试验发现,鸡感染H 11N 9亚型禽流感后,鸡体内外周血单核细胞中ChTLR7的表达量在感染前阶段有短暂的上调,随后表达量下调。表明ChTLR7参与了鸡体内的抗病毒免疫反应。

2.5 ChTLR15 Higgs R等[13]利用生物信息技术对鸡基因组进行分析,发现一新的 TLR,即ChTLR15。ChTLR15同任何已知脊椎动物的TLR都不同,应为家禽所特有。ChTLR15基因已经测序,发现落位于3号染色体,它具有原型的TIR功能域和转膜区域及一个与众不同的细胞外亮氨酸富有区域构造。ChTLR15编码一个含有868个氨基酸的蛋白,ChTLR15 mRNA在健康鸡的脾脏、腔上囊、骨髓中都已被检测到,揭示了这个新受体在宿主防御中的重要作用。用鼠伤寒沙门菌感染鸡,然后进行定量RT-PCR,试验结果显示,鸡被感染后,盲肠中TLR15表达显著提高。体外研究表明,用热灭活的鼠伤寒沙门菌刺激鸡胚胎成纤维细胞,TLR15表达水平也会上升。Jessica R等[9]通过试验发现,在不做任何刺激的条件下,沙门菌抗性鸡群异嗜白粒细胞TLR15 mRNA的表达量比易感鸡群的高。用肠炎沙门菌刺激后,两组的 TLR15 mRNA表达量均比刺激前有明显的增加。这些结果表明,ChTLR15的表达水平与家禽品系相关,并且影响家禽抵抗肠炎沙门菌的能力。

3 ChTLRs的细胞内信号转导

哺乳动物细胞通过识别PAMP激活TLRs引起信号传导级联反应,参与信号转导途径的分子有：接头蛋白MyD88、Toll相互作用蛋白(To11-interacting protein,简称 Tollip)、IL-1受体相关激酶(IL-IR-assiocated kinase,简称IRAK)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,简称 TRAF6)[14]。MyD88结构上有3个功能区域：N端的死亡区域(death domain,DD)、中间区域及C端的TIR。TLRs在细胞内的信号转导机制大体如下：首先激活的TLR募集一种相适配的蛋白,MyD88,与其C端的TIR结合形成受体复合物。接着My D88募集IRAK,My D88的N端死亡结构域与在它下游的信号传导分子IRAK的死亡结构域结合,形成 TLR复合物。Tollip在TLR信号传导途径中起着负调节作用,与IRAK复合,功能与TLR2和 TLR4的作用相关。IRAK发生自身磷酸化并从复合物中解离出来,借此,Tollip可以与 TRAF6相互作用并激活TRAF6,将活化信号传递给TRAF6[15]。通过ECSIT(evolutionarily conserved signaling intermediate in Toll pathways)和MEKK-1(mitogen-activated protein kinase/ERK kinase kinase-1,促分裂原活化蛋白激酶的激酶1),TRAF6激活NF-κB抑制剂激酶(IKK)复合物,导致复合物分解,从而释放NF-κB[16]。借助 TAK1以及相关蛋白 TAB1和TAB2,TRAF6也可以完成上述功能。最后,NF-kB导致某些特定的免疫基因发生转录活化并表达。

目前对鸡体中参与TLR信号转导的分子研究比较少,只有部分分子得到初步认识。利用生物信息学方法,已经鉴定出鸡 Tollip、IRAK-4、Mal和TAB1的全序列和 MyD88、TRAF6、TAK1、TAB2、IKKα和IKKβ的部分序列。鸡细胞内的Mal,是一种类似MyD88的蛋白,结合在IRAK-2上,它也存在于哺乳动物细胞,在其体内作用是募集IRAK-2到被激活的 TLR4上。鸡的Mal全长是242 aa,与人的Mal有52%的同一性。至于鸡Mal是否有上述同样的功能,仍需进一步研究。鸡的IRAK-4全长是414 aa,与人的IRAK-4有58%的同一性。鸡 Tollip的长度是281 aa,与人、鼠的Tollip有94%的同一性。这种高度保守性表明鸡Tollip在功能上与人、鼠的很相似。鸡 TAB1的全长是506 aa,与人的TAB1有86%的同一性。鸡TAB1包含保守的2C蛋白磷酸酶区域,这个区域也存在于人和鼠。研究表明,鸡通过这些分子激活NF-κB的途径,与哺乳动物相似。

4 结语及展望

Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)是一个序列高度保守而古老的家族。它是连接天然免疫和获得性免疫的重要桥梁。自发现 Toll及 TLRs至今,经过多年的研究,人们对 TLRs家族成员的结构、功能、信号转导机制等有了比较深入的了解,并不断发现新的TLRs配体。但这些研究大多仅限于哺乳动物,尤其在人和小鼠中对鸡的研究甚少。如果能进一步详尽地了解ChTLRs的结构功能与其信号转导机制,深入研究ChTLRs与某些疾病的关系,则必将为新型疫苗和免疫佐剂的研发提供新的科学依据,为鸡的抗病育种提供一个新的靶点。ChTLRs在免疫系统中的重要性,预示着对ChTLRs的研究必将掀起一番热潮。

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