连萸降压胶囊对自发性高血压大鼠血清蛋白质组学分析

李 宜，胡元会，齐连芬，王师菡，石 洁，褚瑜光

（1.中国中医科学院 广安门医院，北京 100700；

2.中国中医科学院广安门医院 心血管内科，北京 100053；

3.中国中医科学院广安门医院 功能科，北京 100053）

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目前，从蛋白质组学角度对机体生命活动中某一生理或病理过程进行研究已成为热点。高血压病属中医学“头痛”、“眩晕”等范畴，中医药治疗高血压病有着广阔的研究前景，不仅能有效降低血压水平，还极大地改善患者的生存质量，降低患者并发症的发生。连萸降压胶囊主要成分是黄连素、吴茱萸次碱，2种成分合用降压平稳。本实验采用双向凝胶电泳分离连萸降压胶囊干预自发性高血压大鼠后的血清蛋白质，从蛋白质组学角度探讨连萸降压胶囊的降血压机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 12周龄SHR（清洁Ⅱ级）20只，雌雄各半，购自北京维通利华试验动物技术有限公司（动物合格许可编号 SCXK（京）2007-0001）。

1.1.2 主要实验仪器 Ettan IPG-phor3等电聚焦仪（GE Healhcare，USA）；Ettan DALT3 System垂直电泳（Bio-Rad，USA）；ImageScanner光密度扫描仪（Amersham pharmacia，USA）；UA-16A分光光度计（Shimadzu corporation，Japan）；Imagemaster凝胶图像分析软件（Amersham Pharmacia Biotech，USA）；Auto-REFLEXTMⅢ型基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（Bruker cooperation USA）；Speed Vac真空冷冻干燥离心机（Thermo Savant USA）。

1.1.3 主要药品 连萸降压胶囊：黄连素，兖州大禹制药有限责任公司，批号国药准字040709；吴茱萸次碱，西安冠宇生物技术有限公司，批号Evo070503。两药以3∶1比例加入0.9％生理盐水配成溶液（黄连素240mg/kg+吴茱萸次碱80mg/kg的配液法：黄连素14.4g+吴茱萸次碱4.8g加入600ml 0.9％生理盐水中）。

1.1.4 主要试剂 非线性固相pH梯度干胶条（GE Healhcare pH3～10，18cm）、IPG Buffer（pH 3～10）、十二烷基硫酸钠（SDS）、二硫苏糖醇（DTT）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、溴酚蓝、过硫酸胺（APS）、甘氨酸、丙烯酰胺、IPG-Buffer、覆盖液、琼脂糖、尿素（Urea）、考马斯亮蓝 R-350、标准蛋白标志物购自 A-Pharmacia公司，三氟乙酸（TFA）、N′-甲叉双丙烯酰胺、CHAPS购自Sigma公司，无水醋酸钠、无水碳酸钠、硝酸银、硫代硫酸钠、戊二醛、乙醇、冰醋酸、甲醇、乙腈、甘油、甲醛、1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）、碳酸氢氨（NH4HCO3）、无水乙醇等均为国产分析纯或色谱纯。水为MilliQ超纯水、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮-胰蛋白酶（TPCK-TryPsin）、三氟乙酸（TFA）、乙睛（ACN）、基质 a-氰基-4-羟基肉桂酸（CCA）等均购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药 选取12周龄的SHR 20只，体质量203g～358g，随机数法分为模型组，中药组每组共10只，雌雄各半。模型组：给予0.9％生理盐水10ml/（kg·d）灌胃，每天1次，连续灌胃4周；中药组：按黄连素240mg/（kg·d）+吴茱萸次碱80mg/（kg·d）的剂量配制混悬液，以10ml/（kg·d）灌胃，每天1次，连续灌胃4周。

1.2.2 血清的制备 第4周末，所有大鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于大鼠手术台上，颈部去毛，碘伏消毒皮肤，剪开颈前部皮肤，分离肌肉，暴露左颈动脉，自颈外动脉抽取动脉血，放入空白试管，混匀低温离心（3000r/min，4℃），离心机半径180mm，离心10 min，取上清液，所有样本均于－86℃低温冰箱中保存。每组随机各取5份样品血清，准备蛋白质组学分析。使用时先离心，转速为5000r/min，离心5 min，采用 Bradford法测定血清蛋白浓度。

1.2.3 双向凝胶电泳 模型组、中药组，每组随机各取5份样品进行电泳，第一向按IPGphor等电聚焦系统操作指南进行，电泳参数如下：温度20℃，最大电流 －50μA，电压（V）：30～11h；500～1h；1000～1 h；8000～10 h；合计 23h。在 Ettan DALT3 System垂直电泳槽内进行第二向。电泳条件：恒流40mA 40min、60mA 5h，直至溴酚蓝前沿到达玻璃板底部停止电泳（约5～7h）。银染色后获得凝胶图谱。

1.2.4 凝胶图像分析 采用Image Scanner扫描仪进行扫描并获取图像。以Imagemaster分析软件对其进行图像分析。差异蛋白质点的选择：有2倍以上差异表达（表达上调或下调）。

1.2.5 差异蛋白质点的质谱分析 凝胶考染后，选取差异蛋白质点进行胶内酶解，经水洗、脱色处理后，获得蛋白质肽混合样品。用 Burker公司REFLEXTMⅢ型 MALDI-TOF-MS质谱仪进行分析：线性模式，正离子谱测定，加速电压20KV，反射电压为23KV，质谱信号单次扫描累加50次。基质用CCA，以基质峰和胰蛋白酶自动降解离子峰作为内部标准校正，获得肽质量指纹图谱（PMF）。

1.2.6 数据库查询 获得的PMF图谱用Mascot软件识别单同位素信号峰，获得肽片段的质荷比（M/Z），Mascot查询系统（http://www.matrixscience.co.uk）进行检索。搜索数据库为NCBI蛋白质数据库。检索参数设置为：

Database-NCBInr， Taxonomy-Rattus， Enzyme-Trypsin， Allow up to-1， Variable modifications-Carbamidonethyl（C）和 Oxidation（M），Peptide tol. ±（0.3）。

1.3 统计学方法

所有数据以均数±标准差表示，使用SPSS 11.0统计软件进行统计分析，2组之间比较采用t检验，以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 2组大鼠血清蛋白质双向凝胶电泳（2-DE）图谱

以18cm非线性IPG胶条对血清蛋白进行2-DE，银染后图像分析，蛋白点分布清晰，在相同条件下对模型组、中药组的血清总蛋白，每组各5份样品进行双向电泳，发现5次双向电泳图谱非常相似，分别将其中的一块有大量分辨率高、质量好的蛋白质点胶定为参考胶，进行5块胶间的蛋白质点的匹配，蛋白点经标准化后输出数据到 Excel进行统计分析，组内平均匹配率分别76％、74％，样品重复性好，制备稳定。模型组、中药组的血清双向电泳凝胶上的平均蛋白点分别为：476±30、504±45个。组间平均匹配率65％，可用于差异蛋白质点的分析。

2.2 2组差异表达蛋白质点局部图谱

分析2组图谱，连萸降压胶囊干预自发性高血压大鼠后，有22个蛋白表达发生显著变化，表达增强的15个，表达降低的4个，新增加蛋白点3个。

2.3 质谱分析及鉴定结果

22个差异蛋白质点中，共鉴定出10个蛋白点，另外的蛋白质点，由于没有得到令人满意的肽质量指纹图谱或搜索数据库时不能得到可信度较高的结果而未能鉴定。鉴定出的10个蛋白质为视黄醇结合蛋白、E3泛素连接酶、线粒体膜蛋白、锌指蛋白、T细胞受体、转甲状腺蛋白 A-链、Rho GTPase、methyltransferase，UbiE/COQ5 family、2 个假想蛋白。

3 讨论

高血压病是临床常见病、多发病，随着我国经济的发展和人民生活水平的提高，高血压病的发生率较10年前明显增加［1］且目前没有一种特效抗高血压的西药可以治愈高血压或完全逆转或预防与高血压相关靶器官的病理改变［2］。中医药治疗高血压病疗效确切，改善症状明显，可以同时兼顾高血压并发症和伴随的其他危险因素的治疗。

本实验以自发性高血压大鼠为观察对象，通过蛋白质组学双向电泳技术研究，连萸降压胶囊干预后的自发性高血压大鼠血清蛋白质的不同表达，成功构建2组血清蛋白质双向凝胶电泳图谱。双向凝胶电泳（2-DE）是目前蛋白质组学中用于分离蛋白质最广泛的一种方法。同时2-DE也存在对大分子、疏水蛋白以及极酸极碱蛋白质较难分离的缺点［3］。

连萸降压胶囊干预自发性高血压大鼠后，新出现的蛋白质鉴定为E3泛素连接酶和甲基转移酶（methyltransferase，UbiE/COQ5 family）。E3泛素连接酶负责确定蛋白质泛素化的特异性，识别靶蛋白底物，在蛋白酶体降解蛋白质的过程中起极其重要的作用［4］。蛋白质的泛素化作为真核生物蛋白质降解的重要机制，对许多重要的生物进程如细胞周期、基因转录和细胞信号传导等是至关重要的［5］。甲基结合生物胺类在体内与甲基结合的反应，也称甲基化。甲基来自蛋氨酸，蛋氨酸的甲基经ATP活化成为S-腺苷蛋氨酸，再经甲基转移酶催化，使生物胺类与甲基结合而被解毒排泄，甲基转移酶属于催化底物之间进行某些基团的转移或交换的酶类，酶只对具有特定空间结构的某种底物起作用。Rho家族蛋白与血管狭窄发生过程中血管平滑肌细胞的迁移密切相关。GTPase介导的小分子蛋白和细胞迁移密切相关，阻断Rho可减少血管平滑肌细胞迁移［6］。血清视黄醇结合蛋白是2005年 YangQ等［7］鉴定出的一种新的脂肪因子，血清视黄醇结合蛋白4（RBP4）水平与血压呈正相关，既往研究提示，血清RBP4水平与肥胖、胰岛素抵抗等的发生有关，而胰岛素抵抗与高血压的发生、发展都有密切的关系。

综上所述，鉴定出的这些蛋白质与连萸降压胶囊的降血压和改善症状密切相关，可能是连萸降压胶囊治疗作用的靶点。有关这些显著变化的蛋白质的性质、功能及相互关系尚待进一步研究。

（致谢：本实验得到中国军事医学科学院生物医学分析中心的王鸿丽、赵永强、薛艳等老师的大力协助，在此表示衷心的感谢!）

［1］刘忠仁.我国各地高血压流行病学调查近况［J］.医学综述，2004，10（2）：88-89.

［2］Chobanian AV，Bakris GL，Black HR，et al.The seventh report of the Joint National Committee on prevention，detection，evaluation，and treatment of high blood pressure：the JNC 7 report［J］.JAMA，2003，289（19）：2560-2572.

［3］LOPEZJ L. Two-dimensional electrophoresis in proteome expression analysis［J］.JChromatogr B Analyt Tehnol Biomed Life Sci，2007，849（1-2）：190-202.

［4］Ciechanover A，Orian A，Schwartz A L.The ubiquitin-mediated proteolytic pathway：mode of action and clinical implications［J］.J Cell Biochem，2000，77（S34）：40-51.

［5］Weissman A M.Themes and variations on ubiquitylation［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2001，2（3）：169-178.

［6］Seasholtz TM，Majumdar M，Kaplan D，et al.RHO and RHO kinase mediate thrombin-stimulated VSMC DNA synthesis and gration［J］.Circulation，1999，84：1186-1193.

［7］Yang Q，GrahamTE，ModyN，et al.Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes［J］.Nature，2005，436：356-362.