昆虫抗寒性的研究进展

陈 豪, 梁革梅, 邹朗云, 郭 芳, 吴孔明, 郭予元

(中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)

受季节变化的影响,大多数昆虫在生长发育过程中都要经受冬季低温的制约。越冬是昆虫抵御不良环境,完成生活史的一种生活对策。不同昆虫有着不同的抗寒机制,且同种昆虫的不同发育阶段、不同个体的抗寒性也有很大差异。昆虫抗寒性研究是昆虫生态学和生物进化研究的热点领域,也是害虫预测预报和防治的理论基础。本文从昆虫越冬的主要虫态、昆虫对低温的适应策略、抗寒机制及其与预测预报、综合防治的关系等方面综述了国内外关于昆虫抗寒性及利用的进展。尤其是近些年开展的对昆虫抗寒的生化、分子机制的研究,包括一些抗冻蛋白和热激蛋白的基因、结构、功能的研究等,使得昆虫的抗寒研究取得了突破进展,并使其抗寒理论得到进一步的完善。

1 昆虫越冬的主要虫态

昆虫种类繁多,它们的越冬虫态也呈现出多样性。如亚洲玉米螟[Ostrinia f urnacalis(Guenée)]、高粱条螟[Chilo venosatus(Walker)]等以老熟幼虫在秸秆中越冬,棉铃虫[Helicoverpa armigera(Hübner)]、烟青虫[Helicoverpa assulta(Guenée)]等以蛹在土壤中越冬,绿盲蝽[Apolygus lucorum(Meyer-Dür)]、中黑盲蝽(Adelphocoris suturalis Jakovlev)等主要以卵在棉花枯枝铃壳内或土壤中越冬。此外,有些昆虫还可以以多种虫态越冬,如蝼蛄2～3年一代,以若虫和成虫两种虫态越冬,飞虱以卵和成虫在禾本科杂草中越冬,甜菜象甲(Bothynoderes punctiventris Germar)以成虫和幼虫在土壤中越冬,叶蝉能以各种虫态越冬[1-2]。

2 昆虫对低温的适应策略

食物质量对昆虫的越冬至关重要。Hunter和McNeil等研究表明寄主植物对多食性昆虫幼虫的生长发育、滞育诱导、抗寒能力有重要影响[7];Liu等研究了食物质量对棉铃虫越冬的影响,发现寄主植物营养越丰富,棉铃虫蛹越重,积累的总类脂和糖原也越多,且蛹的过冷却点与这些物质含量有很强的相关性[8]。

不同昆虫的抗寒性差异很大。一般情况下,处在高纬度、高海拔地区的昆虫比低纬度、低海拔地区的昆虫有更强的抗寒能力。极地昆虫的多样性也证明了他们具有很强的抗寒能力。处于不同地理纬度的同一种昆虫,其抗寒能力也不相同。一般来讲,昆虫所在地区纬度越高,其抗寒性越强。低纬度和热带地区的昆虫,其抗寒性偏低,如不同地理起源的白纹伊蚊[Aedesalbopictus(Skuse)]卵的抗寒性就显著不同[3]。

个体的不同发育阶段,其抗寒性也存在差异。通常是越冬虫态的抗寒性最强,休眠或滞育期对低温的耐受能力较强,生长发育期的虫态抗寒性较弱。例如,舞毒蛾[Lymantria dispar(Linnaeus)]的成虫在-4℃时只能存活30 min,而卵在-20℃都不会死亡;甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hübner)]不同虫态抗寒性由弱至强分别是：卵、成虫、幼虫和蛹[4]。

低温对昆虫的生长发育是不利的,但是昆虫在长期的进化中形成了一系列的适应性对策。这些对策大致可以分为两类：一是行为对策或称为生态型对策,即通过某些行为活动寻找躲避场所。如生活在土壤中的黄地老虎[Agrotis segetum(Denis et Schiffermüller)],随着冬季地温的降低,它会潜入到土壤深处以躲避低温伤害;二是生理对策,即通过改变生理状态提高抗寒性。

低温驯化对昆虫抗寒性有着重要的影响[5]。在自然条件下,昆虫越冬前都要经历一个体温渐变的过程,为度过低温环境做些生理准备,这是昆虫种群受到自然界低温驯化的缘故。快速冷驯化(rapid cold-hardening)则是经历短时间的低温驯化,如5、20 min等。对很多昆虫来说,这一过程可以使它们免于遭受过冷却点(super-cooling point,SCP)以上的低温带来的伤害,如蝇类的非滞育虫态,在0℃驯化10～60 min后遭受-10℃的低温胁迫,其存活率可从20%提高到80%[6]。

3 昆虫的抗寒性机制

3.1 昆虫抗寒性的生理生化机制

根据昆虫抗寒性的生理生化机制,可以分为耐寒昆虫(freeze-susceptibles)和耐冻昆虫(freeze-tolerants)[9]。

3.1.1 耐寒性昆虫的抗寒机制

耐寒昆虫一般通过降低过冷却点,减少体内含水量,排除体内冰核物质和积累抗寒物质等方式来抵抗冻害。

3.1.1.1 降低过冷却点

过冷却点是昆虫抗寒性的一个重要指标[10]。在温带、寒带地区,冬季温度通常低于冰点(freezing point,FP),昆虫可以通过体液过冷却的方式,避免结冰造成伤害。飞蝗卵的过冷却点约为-26℃,幼虫通常为-30℃左右,个别种可以达-60℃。鳞翅目昆虫蛹的平均过冷却点(mean super-cooling point,MSCP)很少低于-30℃,成虫的过冷却能力差异较大,具有选择栖境习性的成虫,MSCP常为-10～-20℃[11]。较强的过冷却能力能使虫体在低温下处于过冷却状态而不结冰,从而获得耐寒性。

3.1.1.2 降低体内含水量

耐寒性昆虫在适应寒冷的过程中,体内含水量大大下降,许多昆虫在越冬时体内含水量几乎下降到致死临界点。水分的排除增加了体内溶质的浓度,降低了体液的冰点和过冷却点。此外,由于含水量的降低,体内连续较大的整体水相可以被一些组织或某些高浓度的物质所分离,从而有利于昆虫体液的过冷却。孙绪艮等研究发现桑尺蠖(Phthonandriaatrilineata Butler)幼虫在越冬过程中体内水分含量呈下降趋势[12]。

3.1.1.3 排除体内冰核物质

昆虫体内的冰核可以在体液中或细胞质基质中,也可以是肠道中的食物颗粒及冰核细菌。这些物质在低温时可诱发结冰,导致消化道膨胀破裂而死亡。昆虫是一个含水系统,过冷却点与体内冰核的数量和活性有关。为了避免结冰,昆虫在越冬前把冰核排出体外或使之失去活性,以降低过冷却点,减少越冬死亡率[13]。低温学研究表明：水分保持过冷却的能力与其中存在的冰核有关,当只有同源冰核(homogeneous ice nuclei)存在时,过冷却可以保持-39℃,但是当存在异源冰核(heterogeneous ice nuclei)时,冰核的活性越高,保持过冷却的能力就越低,也就越容易在接近0℃以下时结冰。一些越冬昆虫之所以能够在很低的温度下保持过冷却状态,与其体内缺乏异源冰核有关。生物冰核是自然界冰核活性最高的物质,能在-1.5℃诱发结冰。其中冰核细菌能在昆虫体上起到异源冰核的作用,从而提高虫体的结冰温度。

3.1.1.4 积累抗寒物质

昆虫抗寒性物质包括两类,即小分子的物质和抗冻蛋白(antifreeze proteins,AFPs)。目前已知的小分子抗寒性物质有甘油、山梨醇、甘露醇、五碳多元醇(可能是阿拉伯糖醇或核酸醇)、海藻糖、葡萄糖、果糖以及某些昆虫体内的氨基酸和脂肪酸。Duman对黄粉甲(Tenebrio molitor Linnaeus)等13种昆虫的研究表明,糖蛋白的增加与抗寒力的增强有着十分密切的关系,因而糖蛋白又称为温滞蛋白,温滞蛋白通过吸附到冰核和冰晶表面来阻止水的晶化,从而降低冰点和过冷却点,产生温滞效应[14]。不同昆虫积累的物质种类和含量是不同的,但大多数昆虫都由几种抗寒物质构成一个物质系统。例如Holden报道了欧桦小蠹虫(Scolytus ratzeburgi Janson)幼虫的甘油-山梨醇-葡萄糖-海藻糖系统[15];黄国洋报道了黄地老虎幼虫的小分子糖-氨基酸-糖蛋白系统[16];陈永杰研究证实,桑绢野螟(Diaphania pyloalis Walker)越冬幼虫以“小分子碳水化合物(海藻糖、甘露醇、山梨醇)-氨基酸[丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)]-甘油-蛋白质-结合脂肪”组成抗寒物质系统[17];梁中贵研究认为松阿扁叶峰(Acantholyda posticalis Matsumura)越冬幼虫血淋巴内丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、胱氨酸(Cys)、精氨酸(Arg)等氨基酸的含量在越冬过程中均明显高于越冬前和越冬后,是重要的抗寒物质[18];韩瑞东等研究了赤松毛虫(Dendrolimus spectabilis Butler)越冬幼虫生化物质变化与抗寒性的关系,认为其幼虫越冬的抗寒物质系统为小分子碳水化合物类(山梨醇、海藻糖、葡萄糖)-糖蛋白-氨基酸类(丙氨酸(Ala)、苏氨酸(Thr)、谷氨酸(Glu)等)[19]。

低温下昆虫体内产生的抗冻蛋白能够长时间地维持亚稳定的过冷却状态,这是不耐结冰昆虫的重要抗寒机制。抗冻蛋白是一类能控制冰晶生长和抑制冰晶之间发生重结晶的蛋白质,能以非依数形式降低水溶液的冰点,但对熔点影响甚微,从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现差值,这种差值称为热滞活性或抗冻活性,差值越大抗冻活性也越大[20]。昆虫的体液以及肠液和细胞内液中都有抗冻蛋白的产生,其中对鞘翅目抗冻蛋白的研究比较深入。

3.1.2 耐冻性昆虫的抗寒机制

耐冻性昆虫在低温到来时,并不阻止体内结冰,却能忍受体液结冰。绝大多数耐冻性昆虫血淋巴中有高效的晶核物质,它不受小分子抗寒物质和抗冻蛋白的影响,温度稍低就能有效地激发体液结冰。关于这类昆虫的耐冻机制,普遍认为是因其在较高的零下低温细胞外血淋巴结冰,从而使细胞内其他重要部位免于结冰。此外,在耐冻性昆虫体内也有一些小分子抗冻剂的积累,如甘油、赤鲜糖醇、苏糖醇和基糖等。这些物质含有的羟基能有效地与水结合,减少水的流动性,从而有效地防止结冰对昆虫造成的损害。水流动性的减少可以稳定蛋白质结构,维持膜的流动性,减少快速结冰造成的损伤,协同血淋巴高效晶核,维持昆虫的耐冻性[21-22]。

昆虫的耐冻性适应比耐寒性适应具有明显的优越性,由于血淋巴中的晶核物质活性较消化道和细胞内的大,这对低温休眠、冬季取食和一些内陆高山气候下生活的昆虫极为有利,使它们可以在白昼温度较高时取食,而夜晚低温结冰也不会因消化道内摄入晶核而死亡。

3.2 昆虫抗寒性的分子机制

近年来人们越来越多的关注昆虫抗寒性的分子机制,包括对抗冻蛋白和热激蛋白(heat shock proteins,HSPs,以下统称热激蛋白)的基因、结构、功能的研究等。

随着研究的日益深入,昆虫抗冻蛋白的研究范围越来越广,在昆虫中已经报道了20多种抗冻蛋白,研究对象已涉及弹尾目、襀翅目、直翅目、半翅目、长翅目和鞘翅目等一些昆虫[23-25]。昆虫抗冻蛋白的分子量大都在7～20ku之间,无糖基,含有比鱼类更多的亲水性氨基酸,而且昆虫抗冻蛋白的活性普遍高于鱼类抗冻蛋白的活性,这可能与冬季陆地的温度更低有关[26]。但是,云杉色卷蛾[Choristoneura f umi ferana(Clemens)]抗冻蛋白与鱼类Ⅱ型抗冻蛋白有免疫交叉反应[27-28],说明这些鱼类和昆虫的抗冻蛋白有共同的抗原决定簇。

黄粉甲的抗冻蛋白,含有呈β-螺旋结构的串联重复序列(C1T2X3X4X5X6C7X8X9X10X11X12),12个氨基酸的环与主链保持一致,且保守序列编码的氨基酸在空间结构的位置也保持一致,所有的半胱氨酸(Cys)都高度保守,都以每6个氨基酸残基有1个半胱氨酸的模式始终贯穿于抗冻蛋白的整个氨基酸链中[29-30],被认为是目前所发现的最为有序的蛋白结构。赤翅甲虫(Dendroides canadensis)抗冻蛋白H1组分含有较多的半胱氨酸(15.9%),几乎有1/2的半胱氨酸残基涉及二硫键的生成,二硫键在维持抗冻蛋白高度有序的结构中起到了极其重要的作用[31]。云杉色卷蛾幼虫的抗冻蛋白,富含苏氨酸、L-胱氨酸(L-Cys)、丝氨酸,其总体结构是左手β螺旋,占70%～80%,由6个环构成,氨基端是非完全的环状结构,连接4个由15个氨基酸组成的左手环,羧基端是17个氨基酸构成的右手环,环之间通过二硫键或β折叠连接。这种抗冻蛋白具有Thr-X-Thr模体,其排列与冰的网络结构相吻合,它由14个苏氨酸组成,其中9个与冰相结合,此种结构与抗冻蛋白功能的发挥密切相关[32]。

最近国内也克隆分析了一些具有低温保护作用的抗冻蛋白基因,如杨长庚构建了拟步行虫科光滑鳖甲(Anatolica polita Borealis)的 cDNA文库,并筛选扩增出321 bp的抗冻蛋白基因,该基因可能与抗冻蛋白结合于冰晶生长位点有关[33]。赵干等利用RT-PCR和RACE技术获得准噶尔小胸鳖甲(Microdera punctipennis Dzhungarica)抗冻蛋白基因家族序列19个,光滑鳖甲抗冻蛋白基因家族序列12个以及卵形刺甲[Platyscelis(Pleiopleura)ovata Ballion]抗冻蛋白基因家族序列5个[34]。吕国栋用原核表达系统表达了拟步行虫科喀什琵琶甲(Blapskashgarensis Bates)抗冻蛋白(BkAFP972),细菌低温保护试验表明,喀什琵琶甲抗冻蛋白能够提高细菌在低温环境中的存活率,具有低温保护作用[35]。

热休克蛋白(HSPs)是指生物体细胞在高温(热激)或其他应激原作用下所诱导生成或合成的一组蛋白质。Denlinger等认为热激蛋白在昆虫越冬过程中扮演着重要的角色[36-37]。很多研究表明热激蛋白的表达量与昆虫的滞育密切相关[38-40],最近的研究又发现热激蛋白与昆虫对低温的耐受性密切相关[41-44],Huang等研究了低温诱导热激蛋白与美洲斑潜蝇(Liriomyza sativae Blanchard)生长发育的关系,结果表明 hsp 19.5、hsp20.8、hsp21.7三个基因能被低温诱导表达;hsp19.5、hsp20.8 、hsp21.7、hsp60 、hsp90 五个基因的相对表达量在不同生长发育阶段差异显著,hsp19.5、hsp20.8、hsp21.7在蛹期表达量最高,而hsp60和hsp90的表达量随着生长发育而递增,成虫期最高[45]。这些研究结果进一步增加了人们对热激蛋白基因功能的了解,并为研究昆虫的生长发育和变态提供了新的思路。

3.3 昆虫的滞育与抗寒

滞育(diapause)是由神经激素调节的、呼吸代谢速率缓慢的一种动态过程,是昆虫为躲避不利环境条件而中止发育的一种适应,也是昆虫生活周期与季节变化保持一致的一种基本手段。滞育昆虫在生理上的表现是：生长发育停顿,呼吸率降低,虫体含水量下降,脂肪含量增加,某些酶系活性降低,抗寒性和抗药性增加[46-47]。

昆虫在滞育期间,体内会积累很多物质,如脂肪、糖类等,这与其越冬期间的耐寒能力密切相关。张珺等比较了北京和福州2个地理种群二化螟(Chilo suppressalis Walker)滞育诱导、低温存活、过冷却点和滞育幼虫抗寒性生理指标的差异。研究发现,随着地理纬度的上升,二化螟种群的耐寒性增强,滞育与非滞育幼虫的体重差异显著,滞育幼虫体内的含水量低于非滞育幼虫,蛋白质和糖含量高于非滞育幼虫[48]。

昆虫为躲避不利环境开始滞育,而当环境转变为适宜的生长条件时,又开始恢复生长发育,同时使得两性个体发育齐一,利于生殖交配同步化,因此关于滞育机理的相关研究也引起了大家的关注。Gkouvitsas等表达了影响西非蛀茎夜蛾(Sesamia nonagrioides Lefevre)滞育的2个小片段基因hsp19.5和hsp20.8,发现这2个基因在滞育过程中扮演着不同的角色,hsp20.8在滞育期间表达量下降,滞育解除后表达量上升,而hsp19.5在滞育前后都是持续表达的[49]。

随着蛋白质组学的发展,其相关技术也被用于研究与昆虫滞育相关的蛋白[50]。Li等比较了滞育和非滞育家蝇(Musca domestica Linnaeus)蛹的脑部蛋白组差异,发现热激蛋白在滞育蛹中高量表达,而磷酸烯醇式丙酮酸合成酶、脂肪酸结合蛋白、核酸内切酶等表达量下降[51]。Li等又比较了滞育解除后24 h的家蝇蛹的脑部蛋白组变化,发现有20个蛋白表达量发生了变化,其中11个蛋白的表达量上升了2.5倍,其中有3个蛋白只存在滞育蛹中,滞育解除后脂肪结合蛋白、CG2331-PA 、过氧化氢酶、组蛋白等表达量下降,而且核糖体蛋白 L17A和一个未知蛋白缺失,Western杂交结果表明诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)蛋白的表达量上升[52]。

4 昆虫抗寒与害虫预测预报及防治的关系

昆虫能否成功越冬直接影响其来年的发生量,研究昆虫的抗寒性不仅对于明确其生态机制及进化具有重要意义,而且对于准确进行害虫发生的预测预报和害虫的综合治理研究非常重要。

对于一些世界性的重要害虫,很多昆虫学家都开展了一系列相关研究。吴孔明等研究了我国不同地理种群棉铃虫的抗寒性,并首次提出我国棉铃虫越冬的北界是在1月份-15℃等温线,长江流域的棉铃虫在华北地区难以越冬,华北棉区棉铃虫以滞育蛹越冬,东北棉区一代棉铃虫是由华北地区迁入。这些研究明显提高了我国棉铃虫预报的准确性,为建立我国的棉铃虫区域性灾变预警技术体系奠定了基础[53]。

美国白蛾[Hyphantria cunea(Drury)]属鳞翅目灯蛾科,是一种多食性的检疫性害虫,在世界各地都造成了严重危害[54]。鞠珍较系统地研究了美国白蛾不同时期蛹的抗寒能力变化,结果表明,雌、雄蛹的抗寒能力均呈现出不同的变化趋势：随着冬季低温的到来,其抗寒能力逐渐增强,冬季过后随气温的回升,其抗寒力逐渐减弱;雌、雄蛹的过冷却点和冰点均随气温的变化而变化;体内含水量随时间的推移而升高;体内总脂肪的含量却随气温的降低而升高。美国白蛾蛹的抗寒能力变化的研究,为其发生和预测预报提供了理论依据,对美国白蛾的有效防治具有重要的指导意义和实践价值[55]。

冰核细菌对赤松毛虫幼虫的抗寒能力的影响十分明显。韩瑞东等分析了赤松毛虫越冬行为与温度和抗寒能力的关系,并用冰核细菌接种,明确了该菌对幼虫过冷却点和致死中时的影响。结果表明,冰核细菌可以作为一种低温增效剂,促使赤松毛虫幼虫在高于过冷却点的温度下结冰致死,可以作为一种促冻杀虫剂,利用冬季低温和春季偶然的寒流来防治赤松毛虫[56]。

陈永杰等研究认为冬季寒流对桑螟越冬幼虫的死亡率影响很大,寒流盛行的年份能显著降低来年的虫源基数[3]。我国也针对很多害虫的越冬习性,提出了冬耕冬灌降低早春虫源的综合防治措施,冬耕冬灌的地块棉铃虫蛹的越冬死亡率可达80%～90%,比不进行耕灌的增加1倍左右[57]。随着人们对昆虫抗寒性研究的进一步深入,不仅可以更全面的理解其抗寒机制,而且昆虫抗寒性的生态学意义会得到进一步的应用。

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