新型特异性磷脂酶 A2抑制剂对急性胰腺炎肺损伤的疗效研究

阿布力克木 王卫星 徐胜 张昌威 余佳 陈辰

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)进展快,病程凶险,是临床上常见的严重急腹症,病死率为 15% ～35%[1]。急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是胰腺炎胰外器官损伤中最常见的表现,发生率高达 60%～70%[2],发病 1周死亡约30%存在ALI和急性呼吸窘迫综合征。ⅡA型分泌型磷脂酶A2(groupⅡA secreted phospholipase A2,sPLA2-Ⅱ A)通过直接损伤破坏质膜、间接产生炎性介质、趋化激活炎性细胞,引起肺部炎性反应,对肺泡上皮细胞毛细血管内皮和肺表面活性物质都有直接的损伤作用[3]。本实验使用的 sPLA2-ⅡA由北京大学化学院研制,将其应用于大鼠 SAP模型,探讨该新型特异性磷脂酶 A2(PLA2)抑制剂在 SAP相关性肺损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验分组、模型制备以及获取标本 Wistar大鼠 24只,体重 200～250 g(湖北省疾病预防控制中心提供),随机分为 3组,每组 8只：假手术组(SO组),SAP模型组(SAP组),抑制剂预处理组(抑制剂组,5mg/kg)。实验前禁食 12 h,禁水 4 h。以 10%水合氯醛腹腔注射(3ml/kg)麻醉,无菌操作下行上腹正中切口进腹,采用 4.5号头皮针头穿过十二指肠对系膜缘经乳头逆行插入主胰管,5%牛磺胆酸钠(STC)溶液(1m l/kg)沿胰胆管逆行恒速(0.1ml/m in)注射造模。确认沿胰管周围组织出现水肿、充血,出血等改变,表明造模成功,后关腹。术后皮下补液(2ml/100 g)。

SAP组：术前 30m in股静脉注射等体积不含 sPLA2-ⅡA抑制剂的溶剂(10%DMSO),然后制备胰腺炎模型。SO组：术前30min股静脉注射等体积不含 sPLA2-ⅡA抑制剂的溶剂,胆胰管逆行注射等体积的 0.9%氯化钠溶液。抑制剂组：术前30min股静脉分别注射 10%DMSO溶解的 sPLA2-ⅡA抑制剂(5mg/kg),制备 SAP模型,同 SAP组。

1.2 材料与试剂 STC购自Sigma公司,使用前无菌 0.9%氯化钠溶液配置。新型 sPLA2-ⅡA(pku-mdl-101)由北京大学化学与分子工程学院提供,用 10%DMSO新鲜配置,sPLA2活性测定均采用 sPLA2活性分析试剂盒检测(cayman公司,美国)。

1.3 检测指标

1.3.1 生化指标：采用本院检验科临床使用的全自动生化分析仪测定血清淀粉酶。

1.3.2 胰腺组织病理学检测：大鼠胰腺组织用 10%甲醛固定24 h,石蜡包埋切片,行 HE染色,根据 Sadurska等[4]提出的方法,对胰腺水肿、胰腺腺泡坏死、出血和脂肪坏死、炎性和血管周围炎性浸润光镜下进行组织学评分。

1.3.3 肺组织病理学检测：大鼠肺组织用 10%甲醛固定 24 h,石蜡包埋切片,行 HE染色,光镜下按 Osman等[5]的标准进行组织学评分。

1.3.4 肺湿干比：取大鼠右中肺称量肺湿重,置 60℃烤箱连续烘烤 72h,称量肺干重,计算肺湿干比值。

1.3.5 血清和肺组织 sPLA2-ⅡA活性检测：组织匀浆液由100mmol/L Tris HCl缓冲液,pH值 7.0,包含 1mmol/L EDTA、10mmol/L CaCl2及 0.3mmol/L Triton。按照 2ml匀浆液∶1 g组织的比例,使用 IKA自动匀浆机(德国)冰上匀浆,10 000 r/min低温(4℃)离心 30min,取匀浆液上清。sPLA2活性测定均采用 sPLA2活性分析试剂盒(sPLA2asssay kit)检测(cayman公司,美国),包括 sPLA2分析缓冲液、DTNB、Diheptanoyl Thio-PC底物。

1.3.6 肺组织 sPLA2ⅡA表达：大鼠肺脏组织 PLA2mRNA表达分析：肺脏组织异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA,逆转录反应体系包括细胞总RNA 1μl,5X逆转录反应缓冲液 7μl,随机引物 2μl,M-MLV反转录酶(Gibeo)200U,37℃反应 60min,99℃ 5min终止反应。上机 94℃变性 45 s,54℃退火 45 s,72℃延伸 45 s,共 35个循环。经 2%琼脂糖凝胶电泳,紫外光下观察照相。用生物电泳凝胶成像系统测出PLA2mRNA和 β-actin表达强度,并计算样本扩增产物与β-actin的积分光密度比值。PLA2mRNA引物上游序列 5'-GCTTCTACGGTTGCCATTGT-3';下游序列为：5'-AACTGGGCGTCTTCCCTTT-3'。内参照 βactin(207bp)：上游 5'-CCAACTGGGACGATATGGAG-3';下游'-CAGAGGCATACAGGGACAAC-3';(Invitrogen公司设计并合成)。

1.4 统计学分析 应用 SPSS 13.0统计软件,计量资料以±s表示,多组间进行单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清淀粉酶和胰腺炎病理评分 造模后 12 h,SAP组血清淀粉酶明显高于 SO组(P＜0.01),抑制剂组血清淀粉酶较SAP组明显降低(P＜0.01),但仍高于 SO组(P＜0.01)。造模后 12 h,SO组胰腺结构正常,几乎无水肿、出血及炎性细胞浸润,SAP组胰腺正常结构被破坏,腺泡水肿、出血、坏死明显,大量炎性细胞浸润,病理评分较SO组显著增高(P＜0.01),抑制剂组胰腺腺泡坏死、出血、炎性细胞浸润,病理评分与SAP组比较均有所改善(P＜0.01)。见表 1。

2.2 肺组织病理学检测 大体观察：SO组大鼠肺组织肉眼观正常;SAP组造模后 12h胸腔有积液,肺水肿加剧,肺表面呈暗红色,可见散在小出血点;抑制剂组肺水肿较SAP组减轻。光镜下观察：SO组大鼠肺组织镜下结构基本正常;SAP 12 h组出现肺泡和间质水肿、出血,灶性或片状肺不张,肺泡间隔增宽,大量炎性细胞浸润,肺组织结构紊乱等改变;抑制剂组肺脏上述病变程度明显减轻,表现在肺间质充血、炎细胞浸润减轻。抑制剂组肺组织病理评分较SAP组减轻(P＜0.01)。见表1。2.3 肺湿干重比 SAP组造模后 12 h肺湿干比为 2.214±0.275,抑制剂组肺湿干比 1.568±0.024较 SAP组明显降低(P＜0.01)。SAP组肺湿干比与 SO组 1.500±0.07比较差异有统计学意义(P＜0.01)。见表 1。

表 1 3组大鼠血清淀粉酶、胰腺病理评分、肺病理评分及肺湿干比例比较n=8,±s

表 1 3组大鼠血清淀粉酶、胰腺病理评分、肺病理评分及肺湿干比例比较n=8,±s

注：与 SO组比较,＊P＜0.01;与 SAP组比较,#P＜0.01

组别 淀粉酶(U/L) 胰腺病理评分 肺病理评分 肺湿干比SO组 1 270±400 0.3±0.5 0.23±0.42 1.500±0.701 SAP组 7 272±1 842＊ 11.6 ±1.0＊ 2.24 ±0.79＊ 2.214±0.275＊抑制剂组 4 524 ±605＊# 8.4 ±0.8＊# 1.62 ±0.52＊# 1.568±0.024＊#

2.4 血清和肺组织 PLA2活性 造模后 12 h,SAP组、抑制剂组血清和肺组织 PLA2活性较 SO组均明显升高(P＜0.01),抑制剂组血清和肺组织 PLA2活性与 SAP组比较,差异有统计学意义(P＜0.01)。见表 2。

2.5 肺组织sPLA2-ⅡA mRNA表达分析 SO组大鼠肺组织PLA2mRNA表达微弱,SAP组造模后12h表达水平升高,与 SO组比较差异有统计学意义(P＜0.01);抑制剂组PLA2m RNA表达水平较 SAP组明显降低(P＜0.01),但表达较SO组仍升高(P＜0.01)。 SO组 sPLA2-Ⅱ A mRNA/β-actin灰度比值与SA组和抑制剂组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);SAP组sPLA2-ⅡA mRNA/β-actin灰度比值与抑制剂组比较,差异有统计学意义(P＜0.01)。见表 2、图 1。

表 2 3组大鼠血清和肺组织 PLA 2活性、肺组织PLA2-ⅡA-mRNA/-acti灰度比值比较n=8,±s

表 2 3组大鼠血清和肺组织 PLA 2活性、肺组织PLA2-ⅡA-mRNA/-acti灰度比值比较n=8,±s

注：与SO组比较,＊P＜0.01;与SAP组比较,#P＜0.01

组别血清 PLA2活性(μmol◦ min-1◦ L-1)肺组织 PLA2活性(mol◦ min-1◦ L-1)sPLA2-ⅡA mRNA/β-actin灰度比值SO组 475±50 56±9 1.33±0.27 SAP组 707±48＊ 109±13＊ 1.86±0.11＊抑制剂组 581±58＊# 87±9＊# 1.60±0.13＊#

图 1 肺脏 sPLA2 mRNA表达的结果

3 讨论

PLA2是一类存在于细胞膜的磷脂水解酶,广泛分布于细胞的质膜、细胞器。它分为分泌型 PLA2(sPLA2)、胞浆型 PLA2(cPLA2)及非钙依赖型 PLA2(iPLA2)。sPLA2包括 PLA2-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅸ和Ⅹ,均为小分子水溶性蛋白质,都具有一个含天门冬氨酸和组氨酸的催化位点,其最大活性依赖结合于酶活性中心的 Ca2+浓度以及合适的 pH值水平。其中,sPLA2-ⅡA富二硫键、低分子量(14.4 kDa)、最适 pH值为 7～9,钙离子依赖型。正常哺乳动物组织细胞中sPLA2-ⅡA低表达。急性胰腺炎时 sPLA2在胰腺、肺等强表达,参与了胰腺局部坏死和系统性炎性的进展[6,7]。

本实验建立大鼠 SAP模型,观察肺湿干比例、肺组织病理改变,发现 SAP组大鼠发生了严重的肺损害,同时肺组织sPLA2-ⅡA mRNA表达、sPLA2活性增高,这提示了 sPLA2参与了 SAP相关性肺损害过程。有研究表明,sPLA2-ⅡA作用于肺泡表面活性物质,使其分解为对细胞有毒性的溶血卵磷脂,肺泡活性物质的减少导致肺泡表面张力增加,肺顺应性降低,最终导致肺损伤[8,9]。此外,sPLA2-ⅡA可以直接分解膜磷脂,破坏膜结构,增加细胞膜的通透性,从而直接损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞结构和功能,导致肺组织损伤[9]。通过研究发现,sPLA2-ⅡA可通过NF-kB途径刺激巨噬细胞内iNOS的表达,产生过氧化亚硝酸盐而损伤肺组织[10]。

本研究使用的新型PLA2抑制剂由北京大学化学院研制,是一种特异性分泌型 PLA2的抑制剂,对 sPLA2-ⅡA具有较强抑制作用。我们前期研究当中,发现了 5mg/kg剂量是减轻SAP大鼠胰腺病例损伤的较安全,有效剂量。本研究中,SAP组大鼠血清淀粉酶,胰腺病理评分,血清sPLA2活性等指标高于 SO组,表明 sPLA2与胰腺炎严重程度密切相关。

在应用该抑制剂的SAP大鼠,不仅上述指标均低于 SAP组,而且肺组织 sPLA2-ⅡA mRNA表达降低、sPLA2活性亦明显被抑制,并减轻了肺组织的病理损伤评分。因此,应用该新型PLA2抑制剂对SAP相关性肺损伤较好的保护作用。

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3 Qin S,Pande AH,Nemec KN,et al.The N-term inalα-helix of pancreatic phospholipaseA 2 determ ines productive-mode orientation of the enzyme at themembrane surface.JMol Biol,2004,344：71-89.

4 Sadurska B,Szum i M.PhospholipasesA 2 in mammalian cells：structure,properties,physiological and pathological role.Postepy Hig Med Dosw(Online),2005,29：116-123.

5 Osman MO,Kristensen JU,Jacobsen NO,et al.A monoclonal anti-interleukin-8antibody(WS-4)inhibits cytokine response and acute lung injury in experimental severe acute necrotizing pancreatitis in rabbits.Gut,1998,43：232-239.

6 Miura M,Endo S,Kaku LL,et al.Plasma type II phospholipaseA 2 levels in patients with acute pancreatitis.Res Commun Mol Pathol Pharmacol,2001,109：159-164.

7 Abraham E,Naum C,Bandi V,et al.Efficacy and safety of LY 315920Na/S-5920,a selective inhibitor of 14-kDa groupⅡA secretory phospholipaseA 2,in patients with suspected sepsis and organ failure.Crit Care Med,2003,31：718-728.

8 陈熹,姚恒,纪宗正,等.磷脂酶 A 2对急性胰腺炎大鼠肺损伤的作用.第四军医大学学报,2003,24：955-959.

9 Schrama AJ,de BeaufortAJ,Sukul YR,et al.PhospholipaseA2 is present In meconium and inhibits the activity of Pulmonary surfactantin vitro study.Acta Paediatr,2001,90：412-416.

10 Tsukahara Y,Morisaki T,Horita Y,et al.PhospholipaseA 2 mediates nitric oxide production by alveolarmacrophagesand acute lung injury in pancreatitis.Ann Surg,1999,229：385-392.