酶法制备小黄鱼下脚料调味料的风味前体物质

王 婧，胡梦欣，应苗苗，励建荣,*

(1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室，浙江 杭州 310035；2.温州科技职业学院食品所，浙江 温州 325006)

酶法制备小黄鱼下脚料调味料的风味前体物质

王 婧1，胡梦欣1，应苗苗2，励建荣1,*

(1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室，浙江 杭州 310035；2.温州科技职业学院食品所，浙江 温州 325006)

以小黄鱼下脚料为原料，利用酶解技术获得小黄鱼下脚料风味前体物质，通过单因素及响应面分析，确定碱性蛋白酶(Alcalase)和风味蛋白酶(Flavourzyme)同步酶解工艺，研究料水比、酶解时间、酶用量、初始pH值和酶解温度对酶解液水解度和感官品质的影响。结果表明，优化的酶解工艺条件为料水比1:7(g/mL)、酶解温度55℃、酶解时间6.5h、初始pH8.0、Alcalase用量2.5%、Flavourzyme用量3.0%。在此酶解条件下的水解度为40.11%，所得酶解液中氨基酸含量86.383g/100g，其中必需氨基酸32.785g/100g，鲜味和甘味氨基酸38.384g/100g，与酶解前相比氨基酸含量明显增加，氨基酸总量增加了67.56%，其中必需氨基酸增加了82.02%，呈味氨基酸增加了79.52%，产品具有浓郁的小黄鱼鱼香味。

小黄鱼下脚料；酶解；响应面分析；水解度

近年来，世界渔业产量几乎停滞不前。渔业资源曾经被认为是取之不尽、用之不竭的，导致大量渔业废弃物的丢弃，每年丢弃的废弃物大约20万吨(占总产量的25%)[1]，尤其像小黄鱼等低值鱼类其下脚料占鱼体总量的40%左右，造成了严重的环境污染。尽管一些鱼类下脚料被用来加工鱼粉等产品，但是仍处于低水平重复利用状态，造成大量营养成分(肽、氨基酸等)丢失[2]。因此，低值鱼下脚料的增值开发利用显得愈发重要。

酶解技术属先进的风味提取技术，利用酶解技术制备小黄鱼下脚料酶解液，不仅最大程度地保留了鱼鲜味，而且还得到许多小肽、氨基酸等易于被人体吸收的营养成分和多种风味前体物质[3-4]。因此，以酶解液为基料，结合热反应技术，配以调味辅料，制备风味鲜美、营养丰富、品种多样的天然调味料，具有广阔的市场前景。

本研究以小黄鱼下脚料为原料，运用响应面分析法，采用Alcalase和Flavourzyme同步酶解技术，优化小黄鱼下脚料中风味前体物质制备工艺，获得富含氨基酸、多肽的小黄鱼下脚料酶解液。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小黄鱼下脚料(头、内脏) 瑞安市华忠水产食品有限公司；甲醛(分析纯) 上海申翔化学试剂有限公司；Alcalase(食品级)、Flavourzyme(食品级) 诺维信(中国)生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

LGJ-1冷冻干燥机 上海医用分析仪器厂；Kjeltec 2300凯式定氮仪 福斯分析公司；L-8900氨基酸自动分析仪 日本日立公司；DELTA 320 pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司；07HWS-2数显电热恒温水浴锅 国华电器有限公司；HH-2数显恒温磁力搅拌器 杭州通用电子仪表厂。

1.3 方法

1.3.1 酶解原料制备

小黄鱼下脚料→解冻→匀浆→冷冻干燥→超微粉碎→真空包装(备用)

1.3.2 酶解工艺路线[5]

原料→加水匀浆→一定温度、pH值条件下，加酶反应一定时间→85℃灭酶20min→冷却→离心(9000r/ min，20min)→倾出酶解液，备用

1.3.3 水解度(degree of hydrolysis，DH)的测定

上清液氨基态氮通过甲醛电位滴定法[6]测定，总氮通过凯式定氮法测定。

1.3.4 响应面分析

根据Box-Bohnken中心组合设计原理，对影响小黄鱼下脚料水解度的4个因素各取3个水平，进行响应面分析试验。

1.3.5 数据分析

采用SPSS 13.0软件及SAS程序对结果进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 酶的初步选择

本研究分别选用Trypsin、Pepsin、Papain、 Flavourzyme、Protamex、Alcalase对小黄鱼下脚料进行酶解，在参考所选酶的最适酶解条件及预实验基础上，选取料水比为1:5(g/mL)、酶用量(酶与底物质量比)2%、酶解时间3h、pH7.0、酶解温度55℃条件下，比较各蛋白酶对小黄鱼下脚料水解度和感官评价的影响。其中，Pepsin酶解pH2.5、酶解温度40℃[7]。

如表1所示，在同样的酶解时间下，Alcalase水解度较高，效果较好。从酶解液风味来说，Papain风味最差，有木瓜和鱼腥混合的异味，Trypsin和Pepsin酶解液腥味较大，Flavourzyme酶解液风味最好。单酶酶解时可采用Alcalase或Flavourzyme。Alcalase是一种内切丝氨酸蛋白酶，在海洋性生物资源利用(尤其是酶解鱼类蛋白)上具有显著的优越性[8]；而Flavourzyme是外切蛋白酶和内切蛋白酶的混合物，可用于脱除酶解液的苦味，改善和增进酶解液的风味[9]。

表1 几种蛋白酶对小黄鱼下脚料的酶解效果Table1 Comparison of single enzyme hydrolysis of small yellow croaker scraps with different proteases

2.2 Alcalase和Flavourzyme单因素试验结果

为进一步考察酶对蛋白质水解结果的影响，采用单因素试验分别对两种酶的酶解条件进行分析，包括料水比、酶解时间、酶用量、酶解pH值和酶解温度。结果表明，Alcalase最适酶解条件为料水比1:7(g/mL)、酶解时间4h、酶用量2.5%、初始pH9.0和酶解温度55℃。采用相同的料水比1:7(g/mL)，Flavourzyme对蛋白质的最适酶解条件为酶解时间2.5h，酶用量2.0%，初始pH7.5，酶解温度55℃。

2.3 酶种类和加入顺序的优化[6,10-11]

固定料水比为1:7(g/mL)时，Alcalase和Flavourzyme在最适酶解条件下，分别对两种酶的加入方式进行比较研究，如图1所示。实验结果表明，相对于Flavourzyme，Alcalase对蛋白质的水解度更高。据文献报道，以内切蛋白酶Alcalase启动水解，可给外切-内切蛋白酶混合物Flavourzyme提供更多的作用位点[12]；而另一方面，Flavourzyme的加入能进一步改善酶解液的风味[13]。因此，实验还比较了两种酶同时加入或先后加入的方式对蛋白质酶解结果的影响，发现两种酶同时加入或先加入Alcalase后加入Flavourzyme的方式的酶解效果均较好，水解度最高达35.04%。综合考虑到水解度、酶解液风味及酶解工艺等因素，选择Alcalase和Flavourzyme同步酶解为最适酶解条件。运用SPSS 13.0软件进行方差分析，得到P＜0.05，如表2所示，证明各因素间有显著性差异。

图1 酶解方式对小黄鱼下脚料酶解效果的影响Fig.1 Effect of hydrolysis mode on the DH of small yellow croaker scraps

表2 各因素影响的方差分析结果Table2 Variance analysis for the DH of small yellow croaker scraps with different hydrolysis modes

2.4 同步酶解时间的确定

图2 同步酶解时间对水解度的影响Fig.2 Effect of one-step double enzymatic hydrolysis duration on the DH of small yellow croaker scraps

在料水比1:7(g/mL)、酶解温度55℃、初始pH7.5、Alcalase添加量2.5%、Flavourzyme添加量2%条件下，分别酶解2、3、4、5、6、7、8 h，测样品的水解度，结果见图2。从图2可以看出，当酶解时间在2～6h时，随着酶解时间延长，水解度显著增加，6h以后，趋于平衡，水解度略有下降。这一方面可能是随着酶解反应的进行，体系pH值发生改变，底物浓度降低，造成酶活力的逐渐下降；另一方面可能是酶解产物的反馈抑制作用所致[14]。随酶解时间的延长，样品中的蛋白质不断降解为易于人体吸收的小分子肽和氨基酸。酶解到一定程度，酶解液会出现苦味物质，这与酶解过程中产生的疏水性氨基酸有关[15]。综合考虑经济和风味因素，选定6h为最适反应时间。

2.5 同步酶解初始pH值的选择

酶解pH值对酶催化反应的影响包括两个方面，一是影响酶的稳定性，二则影响酶与底物的结合以及酶催化底物转变成产物。酶解初始pH值过高或过低，均会影响酶的作用效果。结合两种酶的单因素试验结果，选定5个不同水平(初始pH5.5、6.5、7.5、8.5、9.5)考察不同初始pH值对同步酶解效果的影响，结果如图3所示。从图3可知，初始pH值在5.5～8.5范围内上升，水解度不断增加；当pH值大于8.5时，水解度下降，由此可知，同步酶解的最适作用初始pH值为8.5。

图3 复同步酶解初始pH对水解度的影响Fig.3 Effect of initial pH on the DH of small yellow croaker scraps

2.6 采用响应面法优化小黄鱼下脚料的同步酶解工艺

2.6.1 分析因素的选取及分析方案[16]

根据Box-Benhnken模型的中心组合试验设计原理[17]，综合2.2节Alcalase和Flavourzyme单因素试验结果，两种酶的料水比与酶解温度相同，故这里选取小黄鱼下脚料样品的酶解时间、酶解初始pH值、Alcalase用量、Flavourzyme用量4个因素为自变量，水解度为响应值，试验因素水平设计及结果如表3、4所示。

表3 响应面试验因素水平表Table3 Factors and levels in the response surface design

表4 响应面分析结果Table4 Response surface design matrix and experimental results

2.6.2 模型的建立与显著性检验

利用SAS-RSREG程序对响应值和各因素进行多元回归拟合后，得到二次多项回归方程：DH/%＝35.53－1.51A＋0.23B－0.14C－1.60D－1.37AB－0.27AC－0.14AD＋0.15BC－1.10BD－0.27CD－1.49A2－0.66B2－0.80C2－1.07D2

回归方程是模拟4个因素与水解度之间的关系，对回归方程系数显著性检验表及方差分析，可知模型对试验拟合良好，模型的P=0.0463＜0.05，表明该试验模型显著。失拟项P=0.1421＞0.05，说明方程对试验的拟合度较好，此方法可靠，故可用回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析[18]。将回归方程的各项回归系数进行t检验，发现A、D、A2因素显著(P＜0.05)，说明响应值的变化比较复杂，各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

2.6.3 响应面分析图

响应面分析的图形是响应值对各试验因素所构成的三维空间曲面图，它直观地反映了各因素交互作用对响应值的影响。如图4所示，酶解时间和两酶的交互作用，初始pH值和Alcalase的相互作用，Alcalase和 Flavourzyme的交互作用都比较显著。而初始pH值与Flavourzyme用量、酶解时间的交互作用不显著。在酶用量一定的条件下，水解度随着酶解时间的延长而增加，但过长的酶解时间反而使水解度略有下降。这与2.4节结果相符。

图4 各因素间的相关性对水解度的影响Fig.4 Response surface plots showing the pairwise interactive effects of four hydrolysis conditions on the DH of small yellow croaker scraps

2.6.4 最佳酶解条件

通过SAS-RSREG程序岭脊分析得到小黄鱼下脚料的的最佳酶解条件，即料水比1:7(g/mL)、酶解温度55℃、酶解时间6.59h、初始pH7.99、Alcalase用量2.38%、Flavourzyme用量2.93%。在此最优工艺条件下水解度的理论值为37.19%。考虑到实际操作，将小黄鱼下脚料的酶解工艺修正为料水比1:7(g/mL)、酶解温度55℃、酶解时间6.5h、初始pH8.0、Alcalase用量2.5%、Flavourzyme用量3%。为检验RSM法的可靠性，在此条件下做3次平行验证实验，实际测得小黄鱼下脚料水解度为40.11%，与理论预测值基本相符，说明该回归方程能较真实地反映各因素对小黄鱼下脚料酶解效果的影响情况。

2.7 小黄鱼下脚料酶解前后的氨基酸成分分析比较

表5 酶解前后体系的游离氨基酸变化Table5 Change in free amino acid composition of small yellow croaker scraps before and after the optimized hydrolysis

酶解小黄鱼下脚料后，酶解液中富含丰富的游离氨基酸(表5)。其中，必需氨基酸含量(32.785g/100g)占氨基酸总量(86.383g/100g)的37.95%；呈鲜味特征性氨基酸天门冬氨酸(8.006g/100g)和谷氨酸(16.555g/100g)，呈甘味特征性氨基酸丙氨酸(6.380g/100g)和甘氨酸(7.443g/100g)，这4种呈味氨基酸[19]占氨基酸总量的44.43%；苦味氨基酸[14,20]亮氨酸(8.344g/100g)、组氨酸(1.724g/100g)、异亮氨酸(3.634g/100g)、缬氨酸(4.252g/100g)、甲硫氨酸(2.628g/100g)、精氨酸(0.564g/100g)和苯丙氨酸(3.778g/100g)占氨基酸总量的28.85%。与酶解前小黄鱼下脚料中的氨基酸含量相比，氨基酸总量增加了67.56%，必需氨基酸含量增加了82.02%，天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸这4种呈味氨基酸增加了79.52%。值得注意的是，小黄鱼下脚料经酶解后，其苦味氨基酸的含量由32.09%略降至28.85%。因此，小黄鱼下脚料的酶解液营养丰富，具有浓郁的鲜香味，苦味较小，是较为理想的水产调味料基料。

3 结 论

通过酶的筛选实验，初步选定了对小黄鱼下脚料酶解效果较好的碱性蛋白酶和风味蛋白酶作为水解酶。进一步通过单因素和响应面分析确定了A l c a l a s e和Flavourzyme同步酶解的最优条件：料水比1:7(g/mL)、酶解温度55℃、酶解时间6.5h、初始pH8.0、碱性蛋白酶用量2.5%、风味蛋白酶用量3.0%。在此条件下，水解度达到40.11%。该值比响应面模型的预测值37.19%高一些，说明响应面模型可优化酶解工艺条件。酶解液鲜味明显，略有苦味，氨基酸含量为86.383g/100g，其中必需氨基酸含量为32.785g/100g，可作为良好的水产调味料反应基料。酶解液的苦味可通过水产调味料的后续加工过程，如酸调、热反应等方法去除，相关工作正在开展。

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Enzymatic Hydrolysis of Small Yellow Croaker Scraps for Preparing Flavor Precursors

WANG Jing1，HU Meng-xin1，YING Miao-miao2，LI Jian-rong1,*
(1. Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China；2. Food Research Institute, Wenzhou Vocational College of Science and Technology, Wenzhou 325006, China)

Small yellow croaker scraps were enzymatically hydrolyzed to obtain flavor precursors. The simultaneous use of alcalase and flavourzyme was found to be the best choice for the production of flavor precursors with higher degree of hydrolysis (DH), and the hydrolysis conditions including material/liquid ratio, hydrolysis duration, enzyme dosage, initial pH and hydrolysis temperature were optimized by single factor method and response surface methodology based on Box-Benhnken experimental design. The optimized values of the four hydrolysis conditions were determined as follows: material/liquid ratio, 1:7; hydrolysis temperature, 55 ℃; initial pH, 8.0; alcalase dosage, 2.5%; and ourzyme dosage, 3.0%. Under these conditions, the DH was 40.11%, and the contents of total amino acids, essential amino acids and four delicious amino acids in the obtained hydrolysate were 86.383, 32.785 g/100 g and 38.384 g/100 g, increasing by 67.56 %, 82.02 % and 79.52% in comparison with those of the start material, respectively. Moreover, the obtained hydrolysate had a strong flavor of small yellow croaker.

small yellow croaker scraps；enzymolysis；response surface methodology；degree of hydrolysis

TS254.9；TS264.9

A

1002-6630(2010)20-0037-06

2010-01-09

浙江省温州市海洋与渔业局项目

王婧(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为食品加工与制造。E-mail：751285696@qq.com

*通信作者：励建荣(1964—)，男，教授，博士，研究方向为食品加工与安全。E-mail：lijianrong@zjgsu.edu.cn