圣云蓝莓果中锦葵色素-3-半乳糖苷的结构鉴定

李颖畅，吕春茂，孟宪军，马 勇，冯彦博

(1.渤海大学生物与食品科学学院，辽宁 锦州 121000；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110161)

圣云蓝莓果中锦葵色素-3-半乳糖苷的结构鉴定

李颖畅1，吕春茂2，孟宪军2，马 勇1，冯彦博1

(1.渤海大学生物与食品科学学院，辽宁 锦州 121000；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110161)

采用体积分数60%(pH3.0)的乙醇在恒温水浴(40℃)条件下提取圣云蓝莓花色苷，将所得浓缩液经AB-8大孔树脂纯化，40℃减压浓缩，真空干燥得到紫黑色粉末，再经过制备型高效液相色谱分离获得单体化合物。经紫外光谱、红外光谱、质谱、1H和13C核磁共振、薄层色谱对单体化合物进行结构鉴定，确定此化合物为锦葵色素-3-半乳糖苷。

圣云蓝莓果；结构鉴定；锦葵色素-3-半乳糖苷

蓝莓属于杜鹃花科(Ericaceae) 越橘属(Vaccinium. SPP)多年生落叶或常绿灌木[1]。圣云蓝莓属于半高丛品种，果实扁圆形，呈蓝色，过熟时呈蓝黑色，果粉较少，果肉细腻，种子极小，果实可溶性固形物含量12.4%。蓝莓果中含有丰富花色苷类物质，花色苷对人体健康有益，具有多种生物活性，如抗氧化及清除自由基作用、抗突变活性、抗癌活性、抗炎及抗病毒效果，具有广阔的应用前景[1-4]。花色苷单体种类很多，但应用在食品中的主要有天竺葵色素、矢车菊色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素和锦葵色素与葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖各自结合形成的花色苷，且多为单糖和双糖苷。人们对不同植物所含花色苷的种类、结构的研究报道较多，其分离鉴定的方法也有许多种，如纸层析法分离花色苷元[5]、花色苷的光谱鉴定法[6]。高效液相色谱-质谱( HPLC-MS)在目前花色苷鉴定中应用最为广泛[7]，Zhang等[8]利用HPLC-MS联用的方法鉴定了荔枝皮中的花色苷，此法克服了HPLC法缺少标准品的缺陷，大大提高了花色苷鉴定的准确性。有关圣云蓝莓花色苷单体的化学结构研究国内外尚未见报道，为了进一步开发利用圣云蓝莓，本实验对圣云蓝莓的主要花色苷单体进行分离和结构鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

圣云蓝莓果由沈阳市双翼果业生产示范基地提供。

无水乙醇、柠檬酸、柠檬酸钠、甲酸、三氯化铝(均为分析纯)、甲醇(色谱纯) 迪马公司；AB-8大孔树脂 天津南开大学化工厂；自制超纯水。

1.2 仪器与设备

UV-1600型紫外-可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；PHS-25型酸度计 上海理达仪器厂；电热恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪 上海博通经贸有限公司；SHZ-IIIB型循环水真空泵上海华琦科学仪器有限公司；玻璃层析柱(1cm×30cm)

上海青浦沪西仪器厂；DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏仪器设备有限公司； 制备型高效液相色谱仪、质谱仪 美国Agilent公司；红外光谱仪 日本岛津公司；电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；Avatar330型核磁共振仪 美国Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 圣云蓝莓样品的制备

将一定量圣云蓝莓果，破碎，用pH3.0的60%乙醇溶液按1:15(m/V)的比例混合均匀，于40℃下浸提2h后抽滤，收集滤液，40℃减压浓缩得到红色黏稠粗提液。经AB-8大孔树脂纯化，40℃减压浓缩得到纯化的蓝莓花色苷浓缩液，真空干燥得到紫黑色粉末。

1.3.2 圣云蓝莓花色苷单体制备

通过制备型反相高效液相色谱对圣云蓝莓样品分离，流动相为30%甲醇水溶液(含2.0%的甲酸)，梯度洗脱，流速为10mL/min，制备单体化合物。

1.3.3 圣云蓝莓花色苷单体化合物结构鉴定

1.3.3.1 紫外-可见光谱分析

1)结合输电线路停电检修，对OPGW光缆接续盒进行开盒检查。检查光缆接头盒密封良好，并且无腐蚀、损坏或变形等异常情况，防止由于引入缆封堵不严或接续盒安装不正确造成盒内进水结冰导致光纤受力引起断纤故障。同时，做好进站光缆及引下线接地方式的优化设计和技术改造[4-5]。

把蓝莓花色苷单体化合物样品用0.1%盐酸甲醇溶液溶解，并用0.1%盐酸甲醇溶液做参比，用UV1600紫外-可见分光光度计从250～700nm扫描，得到蓝莓花色苷的紫外-可见光谱图。在蓝莓花色苷甲醇溶液中加AlCl3，观察最大吸收波长是否发生位移。

1.3.3.2 红外光谱分析

取少量蓝莓花色苷单体化合物样品置于玛瑙研钵中，再加适量KBr粉末作为载体，研磨后，放入压片模具中，加压，3min后取出样品，放入仪器的样品槽中，用红外光谱仪扫描，得到单体化合物的红外光谱图。

1.3.3.3 高效液相色谱-质谱法

(1)样品处理

将真空干燥的圣云蓝莓样品，用含0.1%盐酸的50%甲醇溶液溶解，配制成质量浓度为2.5mg/mL的溶液，用0.45μm的滤膜过滤，收集滤液。

(2)分析条件

Agilent1100型高效液相色谱仪，紫外检测器，波长：520nm；流动相：A甲醇，B 2.5%甲酸水溶液；分离柱：C18(4.6mm×150mm，5μm)。流速为1mL/min，温度30℃，梯度洗脱程序为：0～8min，5%～20%A，95%～80%B；8～15min，20%～50%A，80%～50%B；15～20min，50%A，50%B；20～20.01min，50%～5%A，50%～95%B；20.01～25min，5%A，95%B。(3)质谱分析

质谱条件为毛细管电流：55nA，电压：3200V；雾化压力：2.76×105Pa；离子稳定强度100%，N2流速9.0mL/min，扫描范围为50～1000u。

1.3.3.4 核磁共振分析

分别将样品用氘代甲醇溶解，采用核磁共振仪作氢谱和碳谱分析，以氘代甲醇为内标。

1.3.3.5 蓝莓花色苷的糖组成测定[9]

将纯化的圣云蓝莓花色苷单体溶于3mol/L的HCl中，在100℃条件下回流水解4～5h，得到棕色溶液，用正戊醇萃取至水层无色，将水层浓缩，得到糖的浓缩液，用薄层层析鉴定糖的组成。配制木糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖标准溶液，质量浓度为1mg/mL，配制一定质量浓度的花色苷单体水解后的糖溶液，在距活化过的薄层板下端1.5cm点样，点间距1.5～2cm。将点好样品的薄层层析板置于盛有展开剂的层析缸中，密封式展开，展开剂距薄层上端1cm时取出，展开剂为氯仿:冰乙酸:水体积比为30:35:5。将展开过的薄层层析板以吹风机吹干，将显色剂(苯胺-二苯胺-磷酸)均匀喷洒在薄层层析板上，此板在100℃烘烤10min即可显色，薄层显色后，将样品图谱与标准图谱比较，确定样品中糖的组成。

2 结果与分析

图1 圣云蓝莓花色苷单体化合物的紫外-可见光谱图Fig.1 Ultraviolet-visible spectrum of monomeric compound

2.1 紫外-可见吸收光谱根据花色苷结构的不同，在可见区最大吸收峰的位置有很大差异。由图1可知，圣云蓝莓花色苷单体化合物在甲醇溶液的特征吸收波长分别在279、535nm左右；在300～330nm间没有吸收峰，说明花色苷分子内没有酰基；向其甲醇溶液中加AlCl3，可见区的最大吸收峰未向长波方向移动，说明此花色苷B-环无邻位酚羟基，因此单体化合物不可能是矢车菊色素、牵牛花色素或飞燕草色素。这一表现与锦葵类花色素的特征吸收相一致[10]。由此可初步推断其成分可能属于锦葵类化合物。

2.2 红外光谱图分析

图2 圣云蓝莓花色苷单体化合物的红外光谱图Fig.2 Infrared spectrum of monomeric compound

由图2可知，圣云蓝莓花色苷单体化合物的主要吸收峰有 3425.273、2928.325、1637.583、1595.046、1515.056、1460.647、1383.8051、1346.255、1205.691、1111.701、1068.425cm-1。根据图2峰的位置和形状，并结合参考文献[10-12]分析确定， 3425.273cm-1是—OH伸缩振动吸收峰，2928.325cm-1是甲氧基 C-H 伸缩振动吸收峰，1383.805、1346.255cm-1，可能是甲氧基C-H 面内弯曲振动吸收峰， 1637.583cm-1可能是C=O 键伸缩振动吸收峰，1595.046、1515.056、1460.647cm-1可能是芳烃骨架C=C 键伸缩振动吸收峰；1205.691cm-1可能是羟基上的C-O伸缩振动吸收峰；1111.701、1068.425cm-1可能是C-O-C伸缩振动吸收峰。以上这些都是花色苷的特征吸收峰，可见此花色苷单体中有苯环、羟基、含氧杂环和甲氧基的特征基团，这些基团也是黄酮类化合物的特征基团，可见此花色苷单体化合物属于黄酮类物质。

2.3 高效液相色谱-质谱分析

图3 圣云蓝莓花色苷单体化合物的一级、二级质谱图Fig.3 [MS]/[MS2] spectrum of monomeric compound

由图3可知，圣云蓝莓花色苷单体化合物的保留时间为7.5min，峰面积百分比为96.23%。可以看出此物质已经达到所需的纯度要求。由分子离子峰为492.8(即493)和子离子峰330.8(331)可知，[MS/MS2] m/z 331.0为花色苷脱掉糖残基后的碎片峰，即锦葵色素配基离子峰，493与331相差162，正好是一个半乳糖或葡萄糖去掉一个H2O之后的相对分子质量，确定连接的糖为半乳糖或葡萄糖，因此，此花色苷单体为锦葵色素的半乳糖苷或葡萄糖苷。

2.4 核磁共振谱图分析

2.5 糖的组成分析

图4 圣云蓝莓花色苷单体化合物糖组成薄层色谱图Fig.4 Thin-layer chromatographic pattern showing the soluble sugar composition of monomeric compound

图5 锦葵色素-3-半乳糖苷结构图Fig.5 Chemical structure of monomeric compound malvidin-3-galactoside

由图4可知，薄层色谱中从左到右各单糖依次为木糖、葡萄糖、半乳糖、样品、阿拉伯糖、果糖。通过样品和其他单糖标准品对比可以看出，圣云蓝莓花色苷单体化合物中主要是半乳糖。

综合紫外-可见光谱、红外光谱、质谱、核磁共振、糖薄层色谱分析，推断单体化合物的主要成分为锦葵色素-3-半乳糖苷，结构见图5。

3 结 论

采用制备型高效液相色谱对大孔树脂纯化后的圣云蓝莓花色苷进行分离，获得圣云蓝莓花色苷单体化合物。通过紫外-可见光谱、红外光谱、高效液相色谱-质谱、核磁共振、薄层色谱等方法对圣云蓝莓花色苷单体进行鉴定，确定此圣云蓝莓花色苷单体为锦葵色素-3-半乳糖苷。圣云蓝莓果实红色素主要成分的鉴定对圣云蓝莓的化学分类及其果实红色素在食品工业中的综合开发利用具有重要的意义。

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Structural Identification of Malvidin-3-galactoside from St. Cloud Blueberry Fruits

LI Ying-chang1，LU Chun-mao2，MENG Xian-jun2，MA Yong1，FENG Yan-bo1
(1.College of Biology and Food Science, Bohai University, Jinzhou 121000, China；2.College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161,China)

The anthocyanins in St. cloud blueberry fruits were extracted with 60% ethanol (pH 3.0) at 40 ℃ and the extract was concentrated, followed by purification with AB-8 macroporous resin and vacuum drying, to obtain a dark purple powder. A monomeric compound was isolated from the powder by preparative high-performance liquid chromatography (HPLC) and identified as malvidin-3-arabinoside by ultraviolet-visible, infrared, mass and nuclear magnetic resource spectroscopy as well as thin layer chromatography. This indicates that St. cloud blueberry fruits are exploitable for further development.

St. cloud blueberry fruits；structural identification；malvidin-3-galactoside

TS264.4

A

1002-6630(2010)23-0014-04

2010-01-19

沈阳市青年人才计划项目(1081240-1-02)

李颖畅(1973—)，女，副教授，博士，研究方向为天然产物功效成分。E-mail：liyingchangsy@126.com