气相色谱-质谱法测定蜂王浆中的植物甾醇组成

徐 响，孙丽萍,*，董 捷，李天骄，穆雪峰，沈新锋

(1.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093；2.国家农产品加工技术研发中心蜂产品分中心，北京 100093)

气相色谱-质谱法测定蜂王浆中的植物甾醇组成

徐 响1,2，孙丽萍1,2,*，董 捷1,2，李天骄1，穆雪峰1，沈新锋1

(1.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093；2.国家农产品加工技术研发中心蜂产品分中心，北京 100093)

为探明蜂王浆中的植物甾醇组成，蜂王浆样品经冻干、萃取得到王浆脂类物质，再经过皂化、衍生后使用HP-5MS柱进行分离，采用GC-MS对蜂王浆中甾醇类物质进行鉴定，并用GC-FID内标法进行定量分析。结果表明：蜂王浆中除含有少量胆固醇外，还含有25-羟基-24-甲基胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、Δ5-燕麦甾醇、Δ7-燕麦甾醇等植物甾醇；蜂王浆中总甾醇含量在51mg/100g鲜王浆以上。其中，25-羟基-24-甲基胆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和Δ5-燕麦甾醇含量较高，分别占总甾醇含量的36.79%、6.30%、19.75%和27.99%。

蜂王浆；植物甾醇；气相色谱-质谱法

蜂王浆是蜂群中哺育工蜂的舌腺和上腭腺等腺体分泌的一种成分复杂的乳浆状物。国内外多年科研和医学临床实践证明，蜂王浆对人类医疗、保健等具有奇特的功效，除作为上佳的营养食品外，还具有增强机体免疫力、延缓衰老、抗疲劳、辅助降血糖、降血压、降血脂等保健功能[1]。

甾醇类化合物广泛分布于生物界，其基本结构为环戊烷多氢菲，并含有羟基。植物甾醇能够防止冠心动脉粥样硬化、抑制人体对胆固醇的吸收、促进胆固醇的降解代谢[2-3]。蜂王浆中的植物甾醇是一类潜在的发挥保健功能的活性物质，因此对蜂王浆中植物甾醇化合物种类和含量进行分析对揭示蜂王浆的作用具有参考价值。据报道[4-5]，蜂王浆中含有丰富的多肽、蛋白质、癸烯酸、维生素、酶类以及其他功能活性物质，但是国内外对蜂王浆中植物甾醇的分离和鉴定报道较少。本实验采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对蜂王浆中植物甾醇组成进行分析，并采用GC-FID对不同植物甾醇含量进行测定，为揭示王浆生理功能作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜蜂王浆 中国农业科学院蜜蜂研究所。

甲醇、乙醇、三氯甲烷、氢氧化钾、正已烷、吡啶(均为分析纯) 北京化工厂；豆甾醇(纯度95%)、5α-胆甾烷、双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)-三甲基氯硅烷(TMCS)(体积比99:1) Sigma公司。

1.2 仪器与设备

7890/5975型气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；2010型GC-FID气相色谱仪 日本岛津公司；LGJ-18S立式冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司。

1.3 样品制备

采用文献[6]的方法提取蜂王浆中的脂类物质。取0.500g样品与10%氢氧化钾乙醇溶液(m/V)10mL加入到50mL三角瓶中，在80℃水浴中回流加热30min后，加入40mL饱和NaCl溶液，转入分液漏斗中，用50mL正己烷在萃取3次，水洗至pH中性后以无水硫酸钠脱水，于旋转蒸发器上40℃蒸干。参考文献[7]的方法硅烷化处理后样品进行色谱分析。

1.4 分析条件

气相色谱条件：毛细管柱：HP-5MS柱(30m× 0.25mm，0.32μm)；升温程序：起始温度150℃，保持4min，以4℃/min升至240℃，保持2min，然后以12℃/min升至310℃，保持13min。进样口温度310℃；载气流速1.0mL/min；分流比20:1。

质谱条件：电子轰击离子源(EI)；电子能量70eV；离子源温度230℃；接口温度300℃；扫描质量范围20～510u。各组分经过与标准品对照及NIST标准谱库检索相匹配，确定其结构。

植物甾醇含量采用GC-FID进行测定，色谱FID温度310℃。以5α-胆甾烷为内标，豆甾醇为标准品建立标准曲线(Y=0.9539X+0.0134，X为峰面积与内标之比，Y为标准品与内标物含量之比，相关系数R2=0.9995)，各植物甾醇含量以豆甾醇含量计。

2 结果与分析

图1 蜂王浆中甾醇类化合物GC-MS总离子色谱图Table 1 GC-MS total ion chromatogram of sterol-TMS ethers in royal jelly

蜂王浆中植物甾醇经过衍生化后GC-MS分析检测，总离子流图见图1。各组分经过标准谱库检索及文献对照，初步确定出甾醇类化合物组成(表1)。

表1 蜂王浆中甾醇类化合物的组成Table 1 Sterol-TMS ether composition of royal jelly

从表1可看出，蜂王浆中除含有二十八烷、三十烷、二十三烷酸和胆固醇外，还含有6种甾醇类化合物，其结构式见图2。其中含量较高的为25-羟基-24-甲基胆固醇(6#化合物)、菜油甾醇(7#化合物)、β-谷甾醇(9#化合物)和Δ5-燕麦甾醇(10#化合物)。6#化合物的特征离子为m/z 73、129、296、343、386、470，推测该化合物为25-羟基-24-甲基胆固醇的两个三甲基硅醚取代物。7#化合物的离子峰与6#化合物部分重叠，谱库检索结果显示其为菜油甾醇三甲基硅醚。天然植物甾醇在结构上与胆固醇相似，如豆甾醇(8#化合物)和β-谷甾醇(9#化合物)是常见的植物甾醇，主要存在于植物的根、茎、叶、果实和种子中，各种植物籽油中含量亦较多[4]。由实验结果可知，以上两种甾醇在蜂王浆中均有检出，尤其是β-谷甾醇(特征离子m/z 121、129、357、396、486)含量较高[8]。另一种含量较高的植物甾醇是Δ5-燕麦甾醇，其结构式如图2(F)所示。此外，还有少量的Δ7-燕麦甾醇(11#化合物)，与Δ5-燕麦甾醇相比，它们在分子侧链上都有一个亚乙基，这可能与两种植物甾醇的抗氧化性有关[9]。

表2 蜂王浆中各种植物甾醇的含量(±s)Table 2 Identified sterols and their contents in royal jelly±s)

表2 蜂王浆中各种植物甾醇的含量(±s)Table 2 Identified sterols and their contents in royal jelly±s)

植物甾醇名称含量/(mg/100g鲜王浆)胆固醇2.91±0.23 25-羟基-24-甲基胆固醇19.12±2.34菜油甾醇3.28±0.36豆甾醇1.00±0.16 β-谷甾醇10.27±0.20 Δ5-燕麦甾醇14.55±0.25 Δ7-燕麦甾醇0.86±0.12总含量51.98±2.01

除气相色谱法外，测定甾醇含量有薄层色谱法、比色法、液相色谱法等[10]，目前对于各种植物油等样品中植物甾醇含量的测定多采用气相色谱-火焰离子化检测器(GC-FID)进行检测[7,11]。本实验采用GC-FID内标法测定蜂王浆中甾醇的含量结果见表2，结果表明，蜂王浆中甾醇的总含量高于51mg/100g鲜王浆。胆固醇、25-羟基-24-甲基胆固醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、Δ5-燕麦甾醇、Δ7-燕麦甾醇分别占总甾醇含量的5.60%、36.79%、6.30%、1.91%、19.75%、27.99%和1.66%。Kodai等[12]研究表明，蜂王浆中含有较多种类的甾醇类化合物，这些甾醇类化合物大多含有28或29个碳原子。蜂王浆中除含有王浆酸、癸二酸、十二碳烯二酸、10-羟基癸酸、以及亚麻酸等脂肪酸外，还含有不同种类的甾醇类化合物。各种脂肪酸、甾醇与多肽、蛋白质、维生素、酶类等活性成分相互影响，协同作用，共同发挥其重要的营养功能和增强免疫、延缓衰老、抗炎、辅助降血糖、降血压、降血脂等功效。由此可见，蜂王浆中植物甾醇的分离及分析对进一步认识蜂王浆的保健功能和深入开发蜂王浆产品具有一定的实际意义。

3 结 论

通过GC-MS对蜂王浆中的甾醇类物质进行分析，

发现蜂王浆中除胆固醇外，含有25-羟基-24-甲基胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、Δ5-燕麦甾醇和Δ7-燕麦甾醇等植物甾醇。GC-FID分析表明，蜂王浆中的总甾醇含量高于51mg/100g鲜王浆，主要含有25-羟基-24-甲基胆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和Δ5-燕麦甾醇，分别占总甾醇含量的36.79%、6.30%、19.75%和27.99%。

[1]蔡柳, 林亲录. 蜂王浆的研究进展[J]. 中国食物与营养, 2007(8): 19-22.

[2]吴素萍, 章中. 植物甾醇的研究现状[J]. 中国食物与营养, 2007(9): 20-22.

[3]刘玮玮, 冯磊. 植物甾醇降血脂作用研究进展[J]. 浙江医学, 2008, 30(2): 202-204.

[4]贺春玲, 嵇保中, 刘曙文, 等. 10-羟基-2-癸烯酸研究进展及展望[J].中国农学通报, 2007, 23(6): 227-231.

[5]张智武, 单斌, 彭文君, 等. 蜂王浆中水溶性蛋白质和活性肽的研究进展[J]. 食品研究与开发, 2007, 28(1): 32-36.

[6]徐响, 孙丽萍, 董捷. 蜂王浆中脂类脂肪酸组成的研究[J]. 食品科学, 2009, 30(14): 213-214.

[7]CHIOU A, KALOGEROPOULOS N, SALTA F N, et al. Pan-frying of French fries in three different edible oils enriched with olive leaf extract: oxidative stability and fate of microconstituents[J]. LWT-Food Science and Technology, 2009, 42(6): 1090-1097.

[8]OSTLUND R J. Phytosterols in human nutrition[J]. Annual Review of Nutrition, 2002, 22: 533-549.

[9]毕小艳, 张彬, 吴宗明. 植物甾醇在禽类生产中的应用研究[J]. 饲料与畜牧, 2009(11): 23-25.

[10]高瑜莹, 裘爱泳, 潘秋琴, 等. 植物甾醇的分析方法[J]. 中国油脂, 2001, 26(1): 25-28.

[11]LI T S C, BEVERIDGE T H J, DROVER J C G. Phytosterol content of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) seed oil: extraction and identification[J]. Food Chemistry, 2007, 101: 1633-1639.

[12]KODAI T, UMEBAYASHI K, NAKATANI T, et al. Compositions of royal jelly. Ⅱ. Organic acid glycosides and sterols of the royal jelly of honeybees (Apis mellifera)[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2007, 55: 1528-1531.

Sterol Composition Analysis of Royal Jelly by Gas Chromatography Coupled with Mass Spectrometry

XU Xiang1,2，SUN Li-ping1,2,*，DONG Jie1,2，LI Tian-jiao1，MU Xue-feng1，SHEN Xin-feng1
(1. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；2. Bee Product Center, National R&D Center for Agro-Food Processing, Beijing 100093, China)

To figure out the sterol composition of royal jelly, royal jelly samples were lyophilized and extracted and the extracted lipid substances were then saponified, derivatized and separated on a HP-5MS column prior to gas chromatography with flame ionization detection (GC-FID ) coupled with mass spectrometric identification of sterols, and quantitative analysis was finally conducted by internal standard method. A small amount of cholesterols was contained in royal jelly, and the main sterols were 25-hydroxy-24-methylcholesterol, campesterol, stigmasterol, β-sitosterol, Δ5-avenasterol and Δ7-avenasterol. The total content of sterols in 100 g of fresh royal jelly was higher than 51 mg. Among these sterols, the most predominant components were 25-hydroxy-24-methylcholesterol, campesterol, β-sitosterol and Δ5-avenasterol, accounting for 36.79%, 6.30%, 19.75% and 27.99%, respectively.

royal jelly；sterol compounds；gas chromatography

TS201.2

A

1002-6630(2010)18-0317-04

2010-06-09

农业部公益性行业(农业)科研专项(nyhyzx07-041)；国家现代农业(蜂)产业技术体系建设专项(NYCYTX-43)

徐响(1983—)，男，助理研究员，硕士，研究方向为蜂产品化学。E-mail：caasxx@163.com

*通信作者：孙丽萍(1963—)，女，研究员，硕士，研究方向为蜂产品化学。E-mail：caasun@126.com