长寿老人源双歧杆菌发酵雪莲果饮料的研制

王 洋，刘宁晶，郑海涛，王 锐，刘丽莎，吕铭洋，李平兰*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，教育部-北京市共建功能乳品重点实验室，北京 100083)

长寿老人源双歧杆菌发酵雪莲果饮料的研制

王 洋，刘宁晶，郑海涛，王 锐，刘丽莎，吕铭洋，李平兰*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，教育部-北京市共建功能乳品重点实验室，北京 100083)

以长寿老人源动物双歧杆菌01(Bifidobacterium animalis 01)发酵雪莲果汁，研制一种新型双歧杆菌活菌饮料。先以活菌数为响应值进行单因素试验，筛选出3个具有显著影响效应的因素——果汁体积分数、赖氨酸添加量、抗坏血酸(VC)添加量，并确定了各因素最大响应区间。然后采用响应曲面法旋转中心组合设计(CCD)，Design expert 7.0软件进行数据分析，建立二次线性回归方程，得到最佳配方为雪莲果汁体积分数50%、赖氨酸添加量0.22%、VC添加量0.21%。终产品感官品质良好，活菌数对数值高达到(8.23±0.09)lg(CFU/mL)，在4℃条件下贮藏12d活菌数保持在106CFU/mL以上。

双歧杆菌；雪莲果；发酵饮料；响应曲面法

双歧杆菌(bifidobacteria)是一类重要的益生菌，在宿主体内发挥着调节肠道菌群、抑制有害菌、营养宿主、增强免疫、抑制肿瘤、延缓衰老等生理功能。双歧杆菌制品是将双歧杆菌经工业化扩大培养，再经口服回归宿主原来的生境，发挥其益生功能的制品。近年来对双歧杆菌保健制品的研究越来越多。在众多双歧杆菌制品中，双歧杆菌和双歧因子共同使用的合生元制剂效果最好。

雪莲果(Smallanthus sonchifolius)根茎含有丰富的果寡糖(约占干物质的60%～70%)[1]，大量的水溶性植物纤维以及18种人体必需的氨基酸。有促进肠道双歧杆菌增殖[2]、改善肠道功能，增强微量元素吸收，调节血糖、血脂及抗肿瘤等保健作用。目前雪莲果多生食，或作烹调辅料。科研人员正在以雪莲果为原料，研发一系列加工产品，如腌制品、风干片、糖果、饮料、乳酸菌发酵饮料等。 目前还没有利用双歧杆菌发酵雪莲果汁制备活性饮料的研究报道。

本研究采用的动物双歧杆菌01(Bifidobacterium animalis 01)菌株来源于广西巴马瑶族自治县长寿老人肠道。前期研究发现其能耐受消化道逆环境[3]，且具有抗

氧化，富硒[4]等多种生理活性功能。B. animalis 01发酵雪莲果汁活性饮品，兼备B. animalis 01和雪莲果的保健功效，具有广阔的市场前景。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜雪莲果 市售；动物双歧杆菌01由中国农业大学食品科学与营养工程学院微生物实验室提供，中国科学院普通微生物菌种保藏中心专利保藏编号1353。

1.2 培养基和果汁配制

种子培养基：MRS液体培养基[5]；计数培养基：添加X-gal(60mg/L)的MRS固体培养基。

灭菌的预还原雪莲果汁制备工艺流程：雪莲果→清洗→去皮→切分成3cm见方的小块→预煮8min灭酶→加水打浆→均质(调节pH7.0)→充氮→灭菌(108℃，20min)。

1.3 种子、发酵雪莲果汁制备及活菌计数

B. animalis 01冻干菌粉于预还原MRS液体培养基中活化3代，恢复活力。接入灭菌的预还原雪莲果汁中，初始活菌数对数值为(5.91±0.07)lg(CFU/mL)，37℃厌氧发酵30h。活菌计数采取鉴别性亨盖特厌氧滚管法[6-7]。

1.4 发酵果汁质量评价

1.4.1 发酵果汁感官评价

采用模糊数学七度标度法，由经过培训的10人组成评分小组。评语论域为V=(1，2，3，4，5，6，7)，其中1为最难接受，2为较难接受，3为稍难接受，4为勉强接受，5为较易接受，6为容易接受，7为最易接受。发酵果汁的评定领域U=(色泽，香气，酸度，甜度，苦涩味，组织状态)，其对应的权重值为X= (0.15，0.20，0.20，0.15，0.20，0.10)[8]。

1.4.2 发酵果汁理化指标测定

可溶性固形物含量：参照GB 12143.1—88《软饮料中可溶性固形物的测定方法》；VC含量：2,6-二氯靛蓝滴定法[9]；还原糖含量：参照GB/T 5009.7—2003《食品中还原糖的测定》；总糖含量：苯酚硫酸法[10]；总酸含量：参照GB/T 12456—1990《食品中总酸的测定方法》(以乳酸计)。

1.4.3 发酵果汁4℃厌氧保藏过程双歧杆菌活菌数量变化

发酵果汁于厌氧瓶中4℃保藏，每24h取样，鉴别性亨盖特厌氧滚管法计数双歧杆菌。

1.5 试验设计与数据处理

1.5.1 单因素试验

依1.2节及1.3节方法制备发酵果汁，进行活菌计数。以发酵终点活菌数对数值为响应值，按照雪莲果汁体积分数、碳源、氮源、生长因子顺序，各因素在前一因素的最佳水平下进行逐级优化。在α=0.05的水平下进行单因素方差分析，判断对发酵果汁活菌数的影响有统计学意义的因素及其最大响应水平范围。

1.5.2 响应曲面法旋转中心组合设计[11](response surface methodology central composite design)与数据分析

依据单因素试验确定的因素及其水平范围，以发酵果汁活菌数对数值为响应值，用Design Expert 7.0[12]软件进行旋转中心组合设计和结果分析，得到二次线性回归方程，预测最优配方并验证。

2 结果与分析

2.1 果汁体积分数对发酵果汁活菌数及感官品质的影响

活性发酵果汁需要具备良好的感官品质和较高的活菌数。在影响发酵果汁活菌数的各项单因素中，雪莲果果汁体积分数对发酵终产品感官品质有显著的影响(P＜0.05)，考察雪莲果汁体积分数分别为20%、40%、60%、80%、100%时发酵果汁的感官品质。发现果汁体积分数为40%、60%、80%的感官得分是可以被大众接受的(表1)，且果汁体积分数为60%时终产品感官得分最高；因此选择40%～80%作为果汁最适浓度范围，考察各浓度对发酵终产品活菌数的影响。图1显示，在果汁体积分数为60%时终产品活菌数显著高于其他浓度(P＜0.05)，为(6.82±0.11)lg(CFU/mL)。在60%果汁中添加碳源，发酵终点活菌数没有提高，可能是雪莲果汁中碳源丰富，能够满足双歧杆菌生长的能量需求，故无需添加碳源。

表1 果汁体积分数对感官指标的影响Table 1 Effect of volume ratio of yacon juice on the sensory characteristics of the beverage

图1 果汁体积分数对发酵果汁活菌数的影响Fig.1 Effect of volume ratio of yacon juice on growth of B. animalis 01

2.2 氮源对发酵果汁活菌数的影响

在体积分数为60%的果汁中添加各种氮源(复原乳、豆乳，添加量为1%；半胱氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸，添加量为0.1%)，结果表明，脱脂复原乳、豆乳、精氨酸、酪氨酸、赖氨酸后对双歧杆菌生长均有促进作用，其中酪氨酸、精氨酸、赖氨酸效果最为显著(P＜0.05)。L-赖氨酸是人体必需氨基酸，且为绝大部分中国人的第一限制性氨基酸，故选用赖氨酸作为补充氮源。图2显示了赖氨酸的添加量对发酵饮料活菌数的影响，赖氨酸添加量分别为0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1.0%。从图2可知，赖氨酸的添加量对发酵终点活菌数的影响显著(P＜0.05)，且活菌数随其添加量的增大呈先增高后降低趋势，在添加量0.25%时达到最大值(8.01±0.12)lg(CFU/mL)。

图2 赖氨酸添加量对发酵果汁活菌数的影响Fig.2 Effects of lysine level on the growth of B. animalis 01

2.3 生长因子对发酵果汁活菌数的影响

图3 抗坏血酸添加量对发酵果汁活菌数的影响Fig.3 Effects of ascorbic acid level on the growth of B.animalis 01

在果汁体积分数为60%、赖氨酸添加量0.25%的果汁中分别添加各种生长因子(硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜、硫酸镁，添加量以金属离子浓度计为1.5mmol/L；磷酸氢二钾、氯化钠、VC、吐温80，添加量0.1%)。其中，氯化钠、磷酸氢二钾、VC对B. animalis 01的增殖有促进作用，且VC对试验菌株的促生长效果最为显著(P＜0.05)。进一步考察不同VC添加量(0.05%、 0.1%、0.2%、0.3%)对果汁发酵过程中双歧杆菌活菌数的影响，随着VC添加量的增大，发酵终点活细胞数逐渐增加，在VC添加量为0.20%时达到最高，对数值为(8.20±0.10)lg(CFU/mL)，添加量再增大，活菌数没有显著提高。

2.4 响应面法优化果汁配方

2.4.1 响应面旋转中心组合设计结果

依据以上单因素试验的结果，选取对发酵果汁活菌数影响最为显著的3个因素——果汁体积分数、赖氨酸添加量、VC添加量，以发酵果汁活菌数对数值为响应值，进行响应面旋转中心组合设计，各因素水平如表2所示，试验设计与结果见表3。利用Design Expert 7.0软件对表3结果进行二次多元回归拟合，得到二次多项回归方程：

Y=8.25+0.11A－0.38B+0.0026C－0.0062AB+ 0.00831AC－0.033BC－0.11A2－0.083B2－0.035C2

式中：Y为发酵果汁活菌数对数值；A为果汁体积分数；B为赖氨酸添加量；C为VC添加量。

方程拟合系数0.98。对上述回归方程进行方差分析(表4)表明，模型达到显著水平，适合对不同配方的发酵果汁活菌数进行分析和预测。

表2 响应面旋转中心组合设计因素水平编码表Table 2 Factors and levels of central composite design

表3 响应面旋转中心组合设计与结果Table 3 Experimental design and results of central composite design

表4 响应曲面模型及其各项方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

2.4.2 发酵果汁配方的优化

利用Design-Expert 7.0软件对表3数据进行二次多元回归拟合，所得二次回归方程的响应曲面图和等高线见图4，可以看出果汁体积分数和VC添加量，赖氨酸和VC添加量对响应值的交互作用显著；果汁体积分数和赖氨酸添加量对交互作用不显著。根据二次回归方程，预测双歧杆菌发酵雪莲果汁的配方为雪莲果汁体积分数50%、赖氨酸添加量0.22%、VC添加量0.21%。响应值8.26lg(CFU/mL)。按照此配方进行验证实验，活菌数可达到(8.23±0.09)lg(CFU/mL)，与模型预测值基本吻合，说明该研究所得出的模型是合理的。

图4 各两因素交互作用的响应面图和等高线图Fig.4 Response surfaces and contour plots showing the interactions of volume ratio of yacon juice, level of lysine and ascorbic acid

2.5 B. animalis 01发酵雪莲果汁饮料质量评价

2.5.1 发酵饮料感官质量评价

以上述优化得到的最优配方制备发酵饮料并进行感官评定，结果见表5。

表5显示，发酵后饮料的感官得分5.80，各项指标良好，说明是一种容易被大众接受的饮料。

2.5.2 发酵饮料理化指标测定

表5 最优配方B. animalis 01雪莲果发酵饮料感官评价得分表Table 5 Sensory characteristics of yacon beverage fermented using B. animalis 01

表6 最优配方B. animalis 01雪莲果发酵饮料各项理化指标Table 6 Physico-chemical properties of yacon beverage fermented using B. animalis 01

表6为最优配方发酵饮料的各项理化指标测定结果。可以看出，发酵果汁可溶性固形物含量为(11±1)%、pH4.3、糖酸比为8.8:1。

2.5.3 发酵果汁贮藏过程双歧杆菌活菌数变化情况

图5 4℃厌氧保藏发酵果汁中双歧杆菌活菌数随时间的变化Fig.5 Survival of Bifidobacterium animalis 01 in the yacon beverage during storage at 4 ℃

由图5可以看出，发酵果汁在贮藏过程中双歧杆菌活菌数量缓慢下降，在12d内双歧杆菌活菌数仍保持在1.0×106CFU/mL(GB 16321—2003《乳酸菌饮料卫生标准》对乳酸菌饮料中乳酸菌活菌数的最低限量)以上。

3 讨 论

雪莲果富含双歧因子低聚果糖，B. animalis 01在单纯雪莲果汁中生长活菌数为(6.82±0.11)lg(CFU/mL)。氮源的添加能够显著促进双歧杆菌的生长，在60%果汁中添加0.1%赖氨酸，发酵终点活菌数提高到(8.01±0.08) lg(CFU/mL)。0.20% VC的添加，使活菌数进一步上升到(8.20±0.10)lg(CFU/mL)。经响应面法优化得到最优配方为雪莲果汁体积分数50%、赖氨酸添加量0.22%、VC添加量0.21%。该配方发酵终点活菌数达(8.23±0.09) lg(CFU/mL)。

双歧杆菌对营养要求严格，在营养丰富的培养基中生长活菌数在108～109CFU/mL，如婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌在补充了碳源的豆浆中生长，最高活菌数分别为8.50CFU/mL和7.93lg(CFU/mL)[13]。动物双歧杆菌乳亚种Bb-12在MRS中生长最高活菌数为8.61lg(CFU/mL)[14]。长双歧杆菌在乳中发酵24h活菌数8.79lg(CFU/mL)[15]，陈佩等[16]研制的胡萝卜红枣双歧杆菌发酵乳饮料的活菌数高达109CFU/mL。可见，本研究终产品的活菌数数量级为108，活菌数较高，且仍有提高的空间，若在本研究的基础上，在雪莲果汁中加入其他果蔬汁成分，有可能得到活菌数更高且风味优良的复合发酵果汁。不同双歧杆菌在同一种培养基中生长情况相似，如动物双歧杆菌乳亚种Bb-12、两歧双歧杆菌B7.1、两歧双歧杆菌B3.2发酵胡萝卜汁，最高活菌数为8.22～8.96lg(CFU/mL)[17]。本研究所得的配方可能适合多种双歧杆菌的生长，为开发一系列双歧杆菌发酵雪莲果汁活性饮品提供参考。

保藏温度对活菌饮品的货架期有显著影响，如婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌发酵豆浆在5℃保藏10d，活菌数分别下降了0.44、3.18lg(CFU/mL)，而在25℃保藏，活菌数很快降低到106CFU/mL以下[13]。B. animalis 01发酵雪莲果汁饮料在4℃厌氧可保存12d，活菌数保持在106CFU/mL以上。作为一种不经过二次杀菌的货架期较短的活菌饮品，该发酵饮料适宜采取冷链销售模式。

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Preparation of Fermented Yacon (Smallanthus sonchifolius) Beverage using Bifidobacterium Strains from Centenarians , Faeces

WANG Yang，LIU Ning-jing，ZHENG Hai-tao，WANG Rui，LIU Li-sha，L. U . Ming-yang，LI Ping-lan*
(Key Laboratory of Function Dairy, Co-constructed by Ministry of Education and Beijing City, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The yacon (Smallanthus sonchifolius) juice was fermented with Bifidobacterium strains derived from centenarians, faeces (Bifidobacterium animalis 01) to prepare a functional beverage. The effects of volume ratio of yacon juice, concentration of lysine and ascorbic acid on the viable bifidobacteria numbers in the fermentation broth were studied by conducting single factor tests. Subsequently, a central composite design involving the above 3 factors at 5 levels was employed and analyzed by response surface method to optimize the fermentation processing. Results showed that the optimum volume ratio of juice was 50%, and optimum concentration of lysine and ascorbic acid was 0.22%, 0.21% respectively. The viable cell numbers of Bifidobacterium animalis 01 at optimal formula could reach up to (8.23±0.03) lg (CFU/mL), and maintained above 106CFU/ mL within 12 days storage at 4 ℃.

Bifidobacterium animal；Smallanthus sonchifolius；fermented beverage；response surface methodology

Q939.99

B

1002-6630(2010)18-0445-05

2010-06-23

国家“863”计划项目(2008AA10Z324)；北京市自然科学基金项目(5072025)

王洋(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为益生菌与益生元的开发与利用。E-mail：chaosheng5@163.com

*通信作者：李平兰(1964—)，女，教授，博士，研究方向为益生菌与益生元的开发与利用。E-mail：lipinglan420@126.com