实时定量PCR在植物真菌病原体定量检测中的应用

李凤兰，李学湛，闵凡祥，韩 峰，魏 琪，冯艳忠，郭 梅*

（1．东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2．黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，哈尔滨 150086；3．黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨 150010）

实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR，RQ PCR）是一种在常规PCR基础上运用荧光能量传递（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FR-ET）技术，在反应体系中添加荧光标记探针，从而巧妙地将核酸扩增与杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起的检测技术。这项技术无需常规PCR后的操作，同时还可以利用反应过程中的荧光探针所发出的荧光的变化对扩增过程进行实时监测[1]。因此，这种技术以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、闭管操作无交叉污染，并可同时检测同一样品中的多种靶序列的优点成为植物病理学研究中的重要方法之一[2]。在植物病原菌检测研究中，实时PCR不仅在植物的病毒性病害[3-5]、线虫病害[6-9]和细菌病害[10-13]的快速检测中得到了充分的应用，并且在植物真菌病害的检测研究中也得到了快速发展。相对常规PCR而言，实时PCR具有显著优势。这种技术避开了过度扩增步骤，大大减少了实验时间和劳动力投入，从而增加了PCR实验的处理量，成为进行大规模分析的自动化检测系统。在定量PCR的鉴定过程中常采用两种主要策略来检测和鉴定真菌小种或菌株的专一性靶序列：①对保守基因进行扩增和测序，保守基因一般是对于所有的真菌都具有的基因，而引物采用通用引物；②采用非专一性随机引物扩增未知基因区域[14]。

1 植物真菌病原体定量PCR检测方法及影响因素

在真菌基因组中，核编码核糖体RNA基因（rDNA）是高度保守的，这为鉴定不同真菌小种提供了一个最佳的靶序列，可以采用通用引物对这些序列进行扩增和测序[15]。根据rDNA的保守区域设计的探针和引物可以对小种、家族，甚至界中相同的核糖体基因进行鉴定[16]。在不同病原真菌中检测到特异DNA片段序列还可以用于不同真菌小种的鉴定。在变化的区域中，ITS是真菌中最广泛使用的鉴定序列[17-19]。本研究组在对马铃薯的镰刀菌进行定量检测研究过程中，利用不同致病小种的ITS区域保守基因特异性序列设计了荧光探针，成功的对黑龙江省马铃薯干腐病的6个主要致病小种及变种进行荧光定量检测。结果表明，采用ITS区域设计引物可以有效的对不同的镰刀菌小种进行鉴定。

要对植物真菌的靶DNA进行准确、可靠和高流通量的定量就需要采用实时PCR的方法。特别是多重PCR（Multiplex PCR）的应用大大提高了实时PCR对植物真菌病原体定性和核酸含量定量的检测能力。这种技术就是在一个反应管中同时加入多对不同PCR引物和相应的模板，可在同一反应管中同时扩增出一条以上的目的基因，进行同时检测、鉴别出多种病原体，在临床混合感染的鉴别诊断上有其独特优势和很高的实用价值，并能大大提高精度节约成本[20]。这种方法可以同时对多个模板进行鉴定，这种特性大大的推进了实时PCR在植物真菌病害病原菌规模化检测中的应用潜力。Winton等采用标有不同荧光基团TaqMan探针同时检测出花旗松（Douglas fir）和病原体Phaeocryptopus gaeumanii的DNA[21]；Ippolito等采用两个不同蝎形引物在一个单管中同时鉴别了两种根霉病原菌（Phytophthora nicotianae和Phytophthora citrophthora）[22]。此外，在常规PCR检测操作过程中，反应结果常受一些天然化合物，例如腐殖酸、鞣酸、木质素混合物等抑制因素的影响，原因是这些抑制因素对PCR反应过程中后期的循环（这些循环对后期产物积累是非常关键的）产生影响。但是在实时分析过程中，这些物质的影响却很小，因为实时定量的试验结果并不依赖于PCR产物的积累，而是通过早期阶段荧光信号的产生来实现的[23]。

在使用实时PCR方法对植物真菌病原体进行定量分析时，还存在着一定的局限性，主要是这种方法不能对样本中生活和死亡病原菌的核酸进行鉴别，因此，在对天然样本进行定量分析时，可能会出现检测结果不确定性[24]。有报道表明，在土壤中核酸会被DNA酶快速降解[25]。核酸酶广泛的分布在环境中，并且在微生物死亡后可以将病原菌的DNA降解掉，但是微生物DNA的降解率在很大程度上依赖于环境条件。有研究发现褐座坚壳菌（Rosellinia necatrix）的DNA在土壤中很快被降解，从而降低了检测结果的假阳性可能性[18]，但是，也有研究表明，土壤中一些化合物可以使DNA在土壤中保持很长时间[26]。为了避免检测到死细胞中DNA而出现假阳性的现象，现在发展起来一种将实时PCR与生物学相结合的技术，即BIO-PCR技术[27]。它不仅增加微生物的生物学扩增的检测敏感度，同时又可以避免从复杂环境样本（如土壤）中提取DNA的问题。这项技术已经对存在于自然土壤中丝核菌（Rhizoctonia solani）[17]和根霉病原菌（Phytophthora nicotianae）[28]进行检测，并取得了较好的效果。

2 土壤栖息的植物真菌病原体定量检测

由于实时PCR的可实时检测性，这项技术也被应用在土壤中真菌病原菌DNA的检测中。Landeweert等从含有多种微生物土壤样品检测出两种外生菌根真菌（Suillus bovinus和Paxillus involutus），并且在研究中发现，随着时间的发展S.bovinusDNA的量增加，而P.involutusDNA的量减少[29]。陶萌等采用实时荧光PCR技术对土壤中粉红粘帚霉高效生防菌株6721进行了定量检测，结果表明，所建立的PCR检测方法灵敏度高、快速实用，相对于以稀释涂板法为代表的传统方法省时、省力、准确性高，而且适合生态学研究的要求[30]。另外，实时PCR技术也被应用在土壤中茄长蠕孢（Helminthosporium solani）[31]，炭疽菌（Colletotrichum coccodes）[32]， 粉 痂 菌（Spongospora subterranea）[33]，腐皮镰孢菌（Fusarium solanif.sp.Phaseoli）和灌木菌根真菌[34]、褐座坚壳菌（Rosellinia necatrix）[18]、疫霉病菌（Phytophthora nicotianae和Phytophthora citrophthora）[22]等真菌 DNA 检测中。

Ippolito等在对土壤中的Phytophthora nicotianae进行定量分析时发现，病原体在选择性培养基（繁殖体/每克土壤）上的接种密度和Ct值之间存在强关联性[28]。因此，实时PCR可以检测土壤菌量阈水平范围，这种菌量阈水平可以预测病原菌在土壤中的潜在发展趋势，因此，可以利用这项技术进行预测性的诊断试验，如果某块田地土壤中病原菌的菌量超过了阈值，就可以确定其为高发病的田地，因此，对土壤中病原菌进行定量分析显得极其重要。另外，在进行杀菌剂剂量选择时，可以将土壤中的真菌繁殖体的阈水平作为依据。例如在柑橘类植物中，如果对于根茎而言，疫霉的数量高于15～20个繁殖体·g-1土（ppg）时确定为易感的，并且高于30 ppg时确定为有抗性的，在这种标准下确定杀菌剂的施用方案也更为经济合理[35]。

3 实时定量PCR对寄主组织中真菌D N A的定量检测

对寄主组织中植物病原体的寄生率进行定量和评估也是实时PCR一个非常有价值的应用。据报道，研究者已经成功对马铃薯中的茄长蠕孢（Helminthosporium solani）、炭疽菌（Colletotrichum coccodes）和 VA 菌根真菌（Glomus mosseae），具有广泛寄主的晚疫病菌（Phytophthora infestans）和柑桔褐腐疫霉（Phytophthora.Citrophthora）[36]，大豆种子中的溃疡病菌（Diaporthe phaseolorum和Phomopsis longicolla）[37]，不同寄主根和树皮中的褐座坚壳菌（Rosellinia necatrix）[18]，柑桔根中的疫霉病菌（Phytophthora nicotianae和Phytophthora.citrophthora）[22]，被感染的大麦种子上的网斑病菌（Pyrenophora teres）[38-39]，玉米，胡椒和辣椒上的黄曲霉菌（Aspergillus flavus）[40]等真病原菌进行了有效的定量分析。Winton等利用两个标有不同荧光集团的探针，同时对寄主花旗松（Douglas fir）和病原菌（Phaeocryptopus gaeumannii）DNA 进行定量[21]。在这个试验中，寄主DNA被当作定量检测的一个内参，这个内参可以作为一个内在的阳性对照，这种内参可以修正由于DNA提取和PCR过程中样品不同带来的差异，同时，他们又将实时PCR检测的方法同子实体丰度法（Fruiting Body Abundance）、麦角固醇含量法（Ergosterol Content）和免疫印迹法（Dot Blot Analysis）等方法进行了比较，发现TaqMan实时PCR对冷杉（Douglasfir needles）体内的真菌相对增长量的计算更准确[41]。胡浩等利用常规PCR和TaqMan探针法、SYBRGreenI荧光染料法两种荧光定量PCR两种方法对柑桔体内的黄龙病病菌的变化动态进行检测，结果表明荧光定量PCR方法的灵敏度比常规PCR高出至少2～3个数量级，确定TaqMan探针法更适合于柑桔黄龙病的检测[42]。

由于高灵敏性和重复性，实时PCR也是检测寄主抗性和易感性微小变化的理想方法。Qi等采用实时PCR的方法准确评估水稻的稻瘟病抵抗水平，结果表明，在叶片出现损伤时，在易感染的植株中稻瘟病病菌的增长比抗性品种高80倍[43]。Hietala等在挪威云杉（Picea abies）上接种了异担孔菌（Heterobasidion annosum），结果表明，在具有高度抗性的植物体上真菌DNA是非常有限的，并且只局限于侵害部位，而在低抗性的植物体上，在出现损害症状之前，真菌DNA已经可以被检测到[44]。

4 结语

随着实时定量PCR技术的快速发展和大量实验经验的积累，特别是这项技术所表现出来的敏感性、快速性和通用性，推动了它在植物真菌研究中快速和广泛发展的进程。实时PCR可以精确的对一些植物真菌病害特性进行研究，相对于常规PCR而言，实时定量PCR分析可以获得一些重要的关键性信息，对于研究寄主-病原菌之间互作机制、病原菌同环境互作机制和mRNA的定量等过程中表现出了其他检测技术无法比拟的优势。虽然，相对常规PCR，应用在实时PCR中的引物和荧光探针的数量是有限的，但是，在将来会有越来越多的引物和探针被发展起来，特别是随着人们对真菌基因组认识的增加，传统PCR诊断技术不断的完善，这些研究基础为实时PCR检测快速发展提供了强有力的保障。因此，在检测的常规服务中实时PCR必将成为大规模诊断植物病害致病真菌的标准方法。

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