胶体金免疫层析技术在动物源性食品中的应用

祁光宇，智晓莹，任维维，黄银军，牟克斌，刘学荣，王 宇，蒋 韬

（1.中农威特生物科技股份有限公司，兰州 730046；2.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室，兰州 730046）

免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。它是继三大免疫标记技术之后又一较为成熟的、得到广泛应用的免疫标记技术。胶体金技术具有方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点，因而特别适合于广大基层检验人员以及大批量检测和大面积普查等，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景，非常适用于动物源性食品的现场快速检测。

1 免疫层析快速诊断试纸条工作的基本原理

免疫胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应中的一种新型免疫标记技术。胶体金是由氯金酸水溶液在还原剂作用下，聚合成特定大小的金颗粒，颗粒之间因静电作用形成一种稳定的胶体状态，也称金溶胶。胶体金由于具有胶体稳定性、蛋白质强吸附性和高电子密度等特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而可用于定性或半定量的快速免疫检测方法中[1]。免疫胶体金技术最初仅用于免疫电镜技术，现已发展到被动凝集试验、光镜染色、免疫印迹、斑点金免疫渗滤法以及免疫层析技术等。目前主要有四种方法用于快速诊断技术：①双抗夹心法：用于检测病原微生物性的大分子抗原的检测[2-3]；②竞争法：用于检测小分子抗原[4-6]；③双抗原夹心法：用于检测特异性的抗体[7]；④反向流动层析法：此法可以同时检测同种病原微生物的抗体IgG和IgM[8]。此外还有双面试纸条法、间接法和捕获法，后两种方法在免疫层析试验中应用较少。目前，该技术已广泛应用于临床诊断、病原微生物的检测和兽药残留。

2 胶体金免疫层析技术在动物源性食品检测中的应用

胶体金免疫层析技术在生物医学上应用较多，在动物源性食品检测领域的应用是近几年才发展起来。国内的研究主要集中在疾病诊断领域，对在动物源性食品检测方面应用的研究刚刚开始。

2.1 在动物源性食品质量控制领域的应用

对于那些不需要精确定量检测，但需要快速得出检测结果的成分分析，胶体金免疫层析技术尤为适用。

牛初乳IgG含量成为评价牛初乳及其制品生物活性的良好指标。李忠秋等采用胶体金标记的标准牛IgG作为竞争抗原[9]，将其包被在试纸条的结合垫上，将自制的兔抗牛IgG抗体固相化在硝酸纤维素膜的检测区。通过牛乳样品中的IgG跟胶体金标记的标准牛IgG竞争结合IgG抗体的结合位点，来反映样品中IgG的水平。该操作所需时间短，可以进行简单的半定量分析，具有良好的特异性。

2.2 在动物源性食品病原微生物检测领域中的应用

动物源性食品安全是一个重要的公共卫生问题。不仅给畜牧业生产直接造成损失，也严重影响个人、家庭、社会、商业及整个国家的经济利益。因此，为了使用安全的动物源性食品，必须从饲养到餐桌全过程采取综合措施，切实做好畜产品安全质量监测，确保生产安全畜产品。由于胶体金免疫层析技术操作简单、检测时间短、便于现场操作，可以为现场执法带来科学依据。

2.2.1 免疫胶体金技术在动物源性食品病毒病诊断中的应用

目前，一些不法商贩在食品行业竞争过程中采用不正当手段，活体带病动物和食用性动物胴体致病菌的超标、农药兽药等的残留、违禁物质的添加等问题层出不穷，给食品安全问题带来了严重的隐患。由于金标试纸条的诊断具有快速性和准确性的优点，也开始被逐渐应用于畜禽病毒病的现场检测。

郑鸣等用胶体金标记抗原和双抗原夹心法建立的猪瘟病毒抗体检测免疫层析试纸条，它可以用来猪瘟的临床诊断，这种检测方法操作简单、灵敏度高、特异性好，并且能区分强弱毒感染[10]；Da等用胶体金标记AIV重组核蛋白制备试纸条，用于检测AIV抗体，试纸条与血凝抑制（HI）试验相同，比琼脂糖凝胶扩散试验敏感[11]；王慧杰等用胶体金标记PCV-2重组Cap蛋白制备胶体金快速诊断试纸，建立检测猪圆环病毒2型Cap抗体的方法[12]。试验结果表明该试纸特异性高，能够区分PCV-2的标准阴、阳性血清。用该试纸在检测来自不同猪场的165份送检疑似血清中与美国间接免疫荧光检测试剂的符合率为85%以上；蒋韬等建立了口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型诊断胶体金免疫层析试剂盒，研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度，可检测到7.8×104LD50（1：128稀释乳鼠毒）的病毒量[13]。同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同，具有较好的重复性。特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原时无交叉反应，试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验，O、A、AsiaⅠ型和阴性样本的符合率分别为92.45%、91.66%、92.75%、100%，定型准确率94.58%。此外，如鸡新城疫、传染性法氏囊病、传染性支气管炎病、雏鹅新型病毒性肠炎等多种疫病的胶体金诊断试纸条也相继研制出来，这给畜禽病毒病的现场检测提供了良好手段。

2.2.2 免疫胶体金技术在动物源性食品细菌病诊断中的应用

动物性食品中常见的致病菌有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、布氏杆菌、霍乱弧菌等[14]。

杜玉萍等以金黄色葡萄球菌菌体抗原免疫家兔获得多克隆抗血清，采用胶体金免疫层析技术二步法检测金黄色葡萄球菌，灵敏度为1×106cfu·mL-1[15]；刁琳琪等用双抗体夹心法的原理，以胶体金标记一株单抗制备的试纸条可快速筛选标本中的大肠杆菌O157，试纸条检测条灵敏度可达105cfu·mL-1，且特异性较高[16]；唐景峰等建立诊断布病的胶体金免疫层析方法体金标记单抗，以多克隆抗体作为检测线检测布病，该种方法与PCR检测符合率为100%[17]；何艳玲等研究了胶体金免疫层析法检测水产品中O1群霍乱弧菌的方法[18]，该方法检测食品中O1群霍乱弧菌的灵敏度为105cfu·mL-1，与食品中常见的致病菌无交叉反应，准确性高，适用于食品的快速检测。胶体金技术在动物源性食品细菌病诊断中的作用已经越来越突出了。

2.2.3 免疫胶体金技术在动物源性食品寄生虫诊断中的应用

大多数寄生虫病是人兽共患性疾病，因此，对畜禽寄生虫病的早期快速诊断具有很重要的公共卫生学意义。彭运潮等利用双抗原夹心法，以日本血吸虫可溶性虫卵抗原（(SEA）为检测抗原研制的试纸条，与ELISA检测结果比较，两种方法具有良好的一致性[19]。秦银霞等以胶体金标SPA和旋毛虫肌幼虫ES抗原制备免疫层析试纸条，试纸条对乡土旋毛虫、布氏旋毛虫、伪旋毛虫及纳氏旋毛虫感染动物血清检测的阳性率均为100%，适合于动物旋毛虫感染的快速血清学诊断[20]。王艳华等将抗弓形虫抗体和弓形虫分泌抗原用胶体金标记后，制备检测弓形虫抗体的免疫胶体金快速试纸条，对已知弓形虫阴性、阳性血清检测，结果与IHA检测结果的符合率为82.5%，而且敏感度高于IHA[21]。

2.3 在动物源性食品兽药残留领域中的快速检测应用

现在兽药残留引起食物中毒和影响畜禽产品出口的报道越来越多。药物残留不仅可以直接对人体产生急慢性毒性作用，引起细菌耐药性的增加，还可以通过环境和食物链的作用间接对人体健康造成潜在危害。近年来免疫胶体金技术在兽药残留快速检测中的应用越来越广泛。

陈小旋[22]用杂交瘤技术制备了3株分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株，并在此基础上建立了克伦特罗金标检测试纸条。试验表明，该试纸最小检出限为10 μg·kg-1，适合非专业人员在屠宰现场检测盐酸克伦特罗。王自良等以BSA-CAPHS免疫Balb/C小鼠，用细胞融合技术筛选抗氯霉素单克隆抗体（CAPmAb）杂交瘤细胞，体内诱生腹水法制备CAPmAb，研制CAP残留快速检测金标试纸（CAP-StriP），与其他酞胺醇类和抗菌素类药物无交叉反应，目测检测限为0.5 μg·L-1[23]；其敏感性与竞争ELISA试剂盒相当符合率为100%；朱继帅采用单克隆抗体技术和胶体金免疫层析技术，合成并制备了链霉素人工抗原、抗链霉素单克隆抗体和胶体金，采用竞争法建立了链霉素胶体金免疫层析试纸条[24]。试验表明，该试纸条检测链霉素的灵敏度达200 ng·mL-1，对新霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、阿米卡星、恩诺沙星、氨苄青霉素、磺胺哇嗯琳的交叉反应率均小于0.1%，能基本满足链霉素残留检测的需要。

2.4 在动物源性食品其他残留领域的快速检测应用

动物源性食品中违禁药物（如β-激动剂、激素等）的残留、重金属和生物毒素含量超标已成了困扰世界食品卫生的难题。这些残留不仅影响我国畜禽产品的出口贸易，同时威胁着消费者的健康。许多国家以兽药残留监控为技术壁垒，阻止我国畜产品的正常出口。

利用免疫胶体金快速诊断来初测农畜产品中的重金属离子含量，可以节省时间，大大加快检测进程，提高现场抽查和快速通关检测的效率。目前，国内外已经建立了针对有机污染物的免疫胶体金检测方法，并且将该方法用于重金属离子的分析检测，迄今为止，免疫胶体金检测技术已经成功用于水中的铟、汞、镉、铅和铀等的检测。

在毒素检测方面，胶体金试纸条也显示出它的优势。赖卫华等研制的胶体金试纸条用以检测赭曲霉毒素A，检测限为10 ng·mL-1[25]。Klewitz等利用胶体金标记技术，分别研制了检测A、B、D、E型肉毒毒素的试纸条，试验的敏感性甚至达到50 pg·mL-1[26]。

近年来，由于国家加强对“瘦肉精”克伦特罗的监控，有效打击了生猪养殖中非法使用“瘦肉精”的行为。但是在养殖业中，“瘦肉精”的替代品莱克多巴胺（Ractopamine，RCT）和沙丁胺醇却又悄然兴起。徐社会将莱克多巴胺（RAC）与BSA偶联制成人工抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术制备了抗RAC单克隆抗体，并利用胶体金免疫层析技术，采用竞争法研制了RAC胶体金免疫层析试纸[27]。试验表明，该试纸检测灵敏度为5 ng·mL-1，在室温干燥条件下可保存12个月以上，与克伦特罗、肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、苯氧丙酚胺、沙丁胺醇和多巴胺的交叉反应性都小于0.03%，试纸灵敏度、稳定性、特异性等均达到检测要求。

3 展望

免疫胶体金技术以其简便快速，特异性强、敏感性高，肉眼判断，试验结果易保存，无需特殊仪器设备和试剂等优点，这些特点都是其他免疫学方法所无法比拟的。但胶体金免疫技术在实际研究及应用过程中仍存在一些不足之处：首先，该方法在检测过程中常出现假阳性和假阴性问题[28]。其次，检测的灵敏度及可重复性程度不高，检测范围需要进一步扩展。最后，因免疫胶体金技术是以胶体金纳米颗粒作为标记物，颗粒本身的一些特性也导致免疫胶体金技术的应用受到一定限制，如在操作过程中要求清洁程度高，胶体金溶液的稳定性较差，存放时间短，胶体金颗粒大，渗透能力较差等[29]。免疫胶体金技术应在解决这些问题的基础上向以下几方面发展：首先，进一步提高检测灵敏度，拓宽检测范围。为放大特异性抗原抗体的反应信号，增强胶体金的显色效果，可采用生物素亲和素系统（BAS）或免疫金银染色法（IGSS）等措施，并结合一些相应的生物传感器、电化学设备来拓宽其检测范围[29]。Tang等基于铂金电极修饰的胶体金提高了生物传感器检测HABS表面抗体的敏感性和稳定性[30]。Kitano等用基于胶体金表面等离子共振效应的电感受器测定胃蛋白酶的亲和常数。其次，实现检测多元化[31]。可采用多膜复合或单膜多元受体固定两种方式，一次检测可同时得到一组结果，节省检测时间及成本，这对于检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值。进一步提高免疫金标方法的敏感性、特异性，并实现多元检测、定量或半定量检测是将来该技术发展的主要方向。随着免疫胶体金新的标记物和制备方法的发展，免疫胶体金技术将会有更为广阔的市场和应用前景。

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