解冻后的卵母细胞质量评定方法研究进展

王义鹏,李向臣,苏晓华,3,曹贵方,关伟军*,马月辉

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193;2.内蒙古农业大学兽医学院,内蒙古呼和浩特 010018;3.东北林业大学野生动物资源学院,黑龙江哈尔滨 150040)

解冻后的卵母细胞质量评定方法研究进展

王义鹏1,2,李向臣1,苏晓华1,3,曹贵方2,关伟军1*,马月辉1

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193;2.内蒙古农业大学兽医学院,内蒙古呼和浩特 010018;3.东北林业大学野生动物资源学院,黑龙江哈尔滨 150040)

卵母细胞的冷冻保存可为体外受精、核移植、转基因动物的研究提供更方便的材料来源,有助于优秀家畜的保种,被广泛应用于辅助生殖领域,同时可以避免胚胎研究过程中的伦理学和法律方面的限制。但是解冻后卵母细胞质量的评定工作各国学者的方法标准不一,不利于进一步研究。论文将从细胞和分子水平就解冻后卵母细胞的质量评定方法做一综述,旨在为解冻后卵母细胞质量的高效评定工作提供参考。

卵母细胞;解冻;质量评定

*通讯作者

随着胚胎工程技术的发展,卵母细胞需求量急剧增加,常规的活体采卵已经不能满足试验的需要,虽然通过屠宰厂收集动物卵巢能获得大量的卵母细胞,但由于不能长时间保存,同时受时间和空间的控制,都在一定程度上限制了胚胎工程及相关学科的发展。卵母细胞冷冻保存技术就是在这种背景下发展起来的一种生物学技术,它可以充分利用各种动物卵母细胞资源,为胚胎工程的发展提供丰富的材料来源。尽管卵母细胞的冷冻保存是一项很有潜力的生物学技术,国内外学者为之进行了大量的研究,但是目前卵母细胞冷冻保存效果并不理想。冷冻保存会对卵母细胞造成一系列形态学、细胞学以及生理、生化方面的影响。目前解冻后卵母细胞的质量评定体系并不能全面反应解冻后卵母细胞的质量,这将不利于该技术的发展。本文综述了目前国内外常用的解冻后卵母细胞的质量评定方法,以期为解冻后卵母细胞质量评定体系的建立提供参考。

虽然解冻前后卵母细胞的评价方法很多,但是大多评价方法都是建立在形态学和分子生物学基础之上的,本文将从这两个方面综述解冻后卵母细胞的评价方法。

1 以形态学为基础的解冻后卵母细胞的评价方法

以形态学为基础的解冻后卵母细胞的评价方法主要是从卵母细胞活率、受精率、胚胎发育率以及第一极体、卵周隙和胞质形态等方面对解冻后的卵母细胞质量做出评价,这些方法最直观的反映了卵母细胞的质量高低,也是卵母细胞质量评价体系中最可靠的方法。

1.1 活率检查法

卵母细胞的冷冻保存实质上是一个脱水的过程,如果冷却速率过快,水分来不及渗出,细胞内会有大量冰晶形成,将对细胞造成致死性损伤;而卵母细胞特有的低体表面积/细胞容积的比率降低了细胞内水分与细胞外冷冻保护剂的交换速度,也增加了细胞内冰晶形成的可能及由此引起的细胞损伤,此外冷冻过程中使用的高浓度保护剂容易造成渗透压损伤[1]。玻璃化冷冻技术与慢速冷冻相比有可以避免细胞内冰晶的优点[2],近几年有取代慢速冷冻的趋势[3-4],但也有研究者指出通过增加蔗糖浓度的方法可以达到类似玻璃化冷冻后的效果[5]。虽然通过改进冷冻保护剂[6]、改变蔗糖的浓度[7]等措施取得了较高的卵母细胞冷冻存活率,但是解冻卵母细胞的受精率和卵裂率都明显降低。

通过活率检查,可以直观的反映冷冻效果的好坏,这也是目前评价解冻后卵母细胞质量最常用的方法。活率检查方法有多种,FDA染色是比较常用的一种,用普通荧光显微镜便可快速确定细胞活率情况。评判标准如下:胞质着色均匀,细胞形态完好即为活细胞;胞质不着色,胞质着色较浅、不均匀,细胞形态发生变化的细胞都归为死细胞。

1.2 体外受精、体外胚胎培养检测法

卵母细胞质量的好坏直接影响卵母细胞的受精率、卵裂率、早期胚胎的存活、妊娠的建立和维持、胎儿的发育,因此这些指标是考察冷冻后卵母细胞质量的可靠依据。冷冻过程中使用的二甲基亚砜、丙二醇、乙二醇等保护剂会提高卵母细胞内钙离子的浓度,从而导致卵母细胞透明带硬化,降低卵母细胞受精率和发育到2-细胞的能力[8],使用无钙冷冻液可以降低此有害作用[9];冻融液的温度的选择也将影响冷冻效果[10]。因此,应用体外受精(IVF)、体外胚胎培养可以从宏观角度最大程度地反映冷冻后卵母细胞质量的高低。

尽管IVF、体外胚胎培养评定要耗费更多时间和人力、物力去检验卵母细胞质量,相对快速评定有一定的滞后性,但这些评定方法体现了卵母细胞进一步发育的能力,是卵母细胞质量高低最直观的反应,是评价冷冻后卵母细胞质量最直接的方法。

1.3 卵子第一极体、卵周隙及胞浆形态建立的评价方法

目前此方法也被广泛应用于卵母细胞解冻后的质量评价,卵母细胞成熟过程中经历两次减数分裂,第1次减数分裂后期,促进复合物(anaphase promoting complex/cyclosome,APC/C)被激活,卵母细胞排出第一极体[11],形成卵周隙。极体的排出表明卵母细胞发育经历了正常的程序;而卵周隙越大,表明细胞质收缩越厉害,导致卵母细胞质量越差。根据卵子第一极体、卵周隙及胞浆形态将卵母细胞分级。Ⅰ级:第一极体完整,圆或卵圆,表面光滑,卵周隙和胞浆正常;Ⅱ级:第一极体完整,圆或椭圆,表面粗糙,卵周隙正常,胞浆异常;Ⅲ级:第一极体不完整、破碎,卵周隙和胞浆正常;Ⅳ级:第一极体巨大型,卵周隙过大,胞浆异常;Ⅴ级:第一极体破碎,卵周隙过大,胞浆异常。研究结果表明,I级卵母细胞体外受精率、优质胚胎率、种植率和临床妊娠率都显著或极显著高于其他各级形态的卵母细胞[12]。说明第一极体形态,卵周隙大小和胞浆正常与否与卵母细胞的受精率和胚胎质量相关密切;根据第一极体、卵周隙和胞浆形态可有效地评价解冻后的卵母细胞的质量。

1.4 纺锤体形态观测法

纺锤体是卵母细胞的一个重要组成部分,在第一次减数分裂期间随着成熟促进因子浓度的增加纺锤体逐渐形成[13],由极间微管、染色体牵丝及区间牵丝排列组成。在细胞分裂过程中,纺锤体对卵母细胞染色体的平衡、运动、分配和极体的排出有非常重要的作用。纺锤体异常,会导致异常的减数分裂和异常受精,第二极体不能排放,形成多精受精或造成染色体数目异常,使胚胎进一步分裂受阻。

纺锤体对温度的改变非常敏感[14],冷冻-解冻过程中很容易造成纺锤体的损伤[15]。研究发现,解冻后的纺锤体组织不能维持原有的高度有序结构,在减数分裂任何时期冷冻保存都会引起纺锤体解体,但也有研究指出纺锤体可在解冻后3 h恢复[16];虽然GV期卵母细胞没有纺锤体结构,并且GV期的卵母细胞玻璃化冷冻并不影响核成熟或者内质网的连续性,但是正常胞质的成熟会因内质网的重聚而受阻断[17]。

LC-PolScope纺锤体成像系统是一种能够对活体细胞纺锤体进行无毒、无害观测的技术。此系统在活体状态下,能轻易地辨明纺缍体的位置与状态,不需对细胞进行固定或染色的步骤,因而使细胞免于受伤或死亡,观察过纺锤体的卵子可以继续受精培养,进一步观察卵母细胞的发育潜能[18-19]。朱亮等应用此成像系统的观察,结果显示观测中有纺锤体的卵母细胞的正常受精率和良好胚胎形成率均明显高于无纺锤体的卵母细胞。这说明成熟卵母细胞纺锤体的存在可以反映其质量的高低。因此运用此系统观察解冻后经培养的卵母细胞的纺锤体形态可以作为一种评判解冻后卵母细胞质量高低的手段。

2 以分子生物学为基础的解冻后卵母细胞质量评价方法

以分子生物学为基础的解冻后卵母细胞的质量评价方法主要是应用电泳、免疫荧光等分子生物学方法检测解冻后卵母细胞的细胞器数量、形态等是否正常,从而间接反应解冻后卵母细胞质量的高低。

2.1 琼脂糖电泳检测卵丘颗粒细胞凋亡

颗粒细胞在卵母细胞体外成熟和体外受精进程中具有重要的作用,能显著提高卵母细胞体外成熟和体外受精率。在卵母细胞体外成熟(IVM)技术中,卵的筛选标准之一是颗粒细胞的层数及完整性。颗粒细胞对卵母细胞的核成熟、胞浆成熟和保护其发育潜能有重要的作用,体外培养保留卵丘细胞可促进更多的卵母细胞发育成熟,增加优质胚胎率[18]。研究表明,所取卵周围的颗粒细胞层数越多,颗粒细胞越完整,越有利于卵以后的发育,能显著提高移植率。但是冷冻-解冻过程中会有颗粒细胞从卵母细胞表面丢失,还有部分颗粒细胞会发生凋亡,这些都将直接影响卵母细胞的发育潜能。

分别收集解冻后单卵的卵丘颗粒细胞,经蛋白酶K、100 g/L十二烷基磺酸钠(SDS)处理,放入37℃的水浴箱中轻摇过夜后,提取核DNA进行琼脂糖凝胶电泳。根据电泳结果可将解冻后的卵母细胞分为优质卵母细胞和非优质卵母细胞两类,经琼脂糖凝胶电泳后形成明显DNA梯带者为非优质卵母细胞;经琼脂糖凝胶电泳只形成1条～2条大分子质量DNA条带者为优质卵母细胞。其中优质卵母细胞适宜进行体外受精和核移植等操作,而非优质卵母细胞不适宜进行后续操作。

2.2 线粒体和细胞质的区室化观测法

线粒体作为细胞质内最重要的细胞器和能源基地,为卵母细胞成熟和早期胚胎发育提供能量。长期以来,人们认为在哺乳动物卵母细胞和早期胚胎发育过程中线粒体的功能只是产生ATP,提供能量。近年来随着研究的深入,卵母细胞和早期胚胎发育过程中线粒体的作用逐渐为人们所认识。除了在细胞代谢中起主导作用,其形态、数量及分布的变化与细胞的代谢水平、增殖及分化密切相关。卵母细胞成熟时线粒体由皮质转向胞质中央区扩散,有利于卵母细胞成熟过程中能量的利用。因而线粒体的形态、数量及分布可以作为评定卵母细胞胞质成熟度的依据。通过对哺乳动物卵母细胞内线粒体超微结构的观察,提示线粒体超微结构缺陷可能与早期胚胎发育阻滞或异常有关。研究发现受精失败的卵母细胞内线粒体呈空泡状,数目明显减少;发育阻滞的胚内核周线粒体分布明显减少,线粒体嵴伸长能力减弱,这些结果提示线粒体的数目和超微结构会影响卵母细胞的受精和早期胚胎的发育[19]。这可能是由于线粒体超微结构缺陷引起线粒体代谢水平与胞质内局部能量需求不协调,引起线粒体氧化磷酸化水平异常,而引发早期胚胎发育阻滞或异常[20]。

冷冻保存会导致卵母细胞内线粒体的损伤,主要表现在嵴不清楚或扩张、极性消失、分布发生紊乱等。Jones A等[21]研究指出,卵母细胞冷冻-解冻后线粒体分布极性的丧失,将导致受精时钙离子信号传递受阻,并可能影响线粒体为受精提供能量。

细胞质的区室化作用同样被认为是协调胞核和胞质成熟的重要因素[22]。线粒体的活性和在胞质中的分布可作为胞质区室化的标记,是卵母细胞成熟变化特征的众多标志之一。在卵母细胞成熟过程中多数物种线粒体的分布形式和代谢活力均在不断变化。胞质中由微管网络介导的线粒体迁移运动过程对于卵母细胞体外成熟条件下获得完整的发育能力是必需的。经荧光染色后在激光共聚焦显微镜下可以观察到卵母细胞中的线粒体以及胞质中由微管网络介导的线粒体迁移运动[23]。

因此,通过荧光染色结合共聚焦显微镜观察卵母细胞线粒体、微管的分布可反映卵母细胞胞质区室化的程度并能以此评定卵母细胞的质量。

3 小结

以形态学为基础的评定方法以不损伤细胞为目的,因而不会对细胞的进一步发育造成不利影响,非常适用于辅助生殖技术。以分子生物学为基础的评定方法是建立在卵母细胞细胞器以及生化变化基础上,主要以测定细胞内有关物质的变化为手段,用于测定后的细胞不再具有进一步发育的能力,但测定结果具有可量化性、准确性和客观性,适用的范围更加的广泛。虽然这些评定方法都有各自的优点,但也有不可避免的缺陷,随着评定体系的完善,也必将推动卵母细胞冷冻技术的进一步发展[24]。

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Progress on Quality Assessment of Oocytes After Thawing

WANG Yi-peng1,2,LI Xiang-chen1,SU Xiao-hua1,3,CAO Gui-fang2,GUAN Wei-jun1,MA Yue-hui1

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Chinese Academy of Agricultural Science,Beijing,100193,China;
2.College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot,Inner Mongolia,010018,China;
3.College of Wildli fe Resources,Northeast Forestry University,Harbin,Heilongjiang,150040,China)

Cryopreservation of oocytes can provide more convenient material resources forin vitrofertilization,nuclear transplantation and the development of transgenic animals,also it contributes to preservation of excellent livestock breeds.This technique is used extensively in the field of assisted reproduction,avoiding the ethical and legal restrictions in embryo researches.However,there has no unified method for assessment of oocytes after thawing among the scholars from various countries,which is not conducive to further studies.In this paper,the quality assessment methods of oocytes after thawing were reviewed in order to offer a reference for efficient quality assessment of oocytes.

oocytes;thawing;quality assessment

S821.36

A

1007-5038(2010)09-0101-04

2010-03-15

国家科技支撑计划项目(2006BAD13B08;2008BADB2B01);转基因生物新品种培育科技重大专项(2008ZX08009-003);“863”课题(2006AA10Z198)

王义鹏(1983-),男,山东临沂人,硕士研究生,主要从事动物组织胚胎与发育生物学研究。