副衣原体的生物学特征及分离培养的研究进展

黄新蓉 刘劼

副衣原体的生物学特征及分离培养的研究进展

黄新蓉 刘劼

副衣原体是1997年初从2例女性阿米巴感染者鼻黏膜中分离出来的细胞内共生微生物。现有的证据表明副衣原体是引起人类呼吸道感染的重要病原体。因此，其分离培养对研究其致病机制以及快速诊断具有重要的意义。本文就近年来有关副衣原体的生物学特征、分离培养方法以及快速诊断方面的研究进展作一综述。

1 副衣原体的分类

除众所周知的经典衣原体家族外，最新发现的衣原体家族成员有：副衣原体科(parachlamydiaceae)，西门坎氏菌科(Simkaniaceae)和石德菌科(Waddliaceae)。目前研究表明，副衣原体科主要分为棘阿米巴副衣原体(parachlamydia acanthamoeba PA)和哈氏变形虫新衣原体(Neochlamydia artmanellae NH)两个属。副衣原体自然感染阿米巴，与衣原体属的复制周期相似，16SrRNA的同源性为80%～90%[1]。

2 副衣原体的形态学

副衣原体和其他衣原体一样，具有独特的发育周期，即原体(elmentary body EB)和网状体(reticulate body RB)，其中RB代谢相对活跃，但无感染性[2-3]。Greub G[2]等在共同培养PA菌株UWC1和活性淤泥时，用电镜观察到副衣原体UV-7位于UWC1空泡中。其中EB直径约为0.3～0.5μm，RB轻微增大，直径约为0.5～0.7μm，不同的菌株原体和网状体直径相差比较大。

近年Gilbert等用多食棘阿米巴Linc-AP1与Bn9和Hall，s球菌分别在PYG培养基中共同培养，分别于8、36和144h用电子显微镜进行观察，结果发现有5例多食棘阿米巴滋养体被PA感染，同时在阿米巴内、外均可观察到新月体，推测其主要功能是延长潜伏期。另外，还可以用SAMBA软件对新月体进行形态和定量分析，对多食棘阿米巴内副衣原体的生命周期进行量化分析[3]。随后Greub G[4]等的研究进一步证实PA可能存在第三种发育阶段—新月体期，此阶段很少被观察到，可能是副衣原体的这个生长发育阶段不具有明显的特征，新月体在其他衣原体属中并未发现。

3 副衣原体宿主的选择

众所周知自生生活阿米巴(Free-living amoebae FLA)是细菌共生生物[2]，而副衣原体是主要胞内寄生物之一。研究证实副衣原体难以在无细胞的纯培养基内生长，从而可证明此类细菌为专性的胞内共生体，副衣原体比较合适的宿主是棘阿米巴，并且极易与棘阿米巴共生，将其作为复制的载体，且具有在不同棘阿米巴中复制增殖的能力[5]。

4 副衣原体菌株感染宿主细胞

1995年Kahane等开拓了在实验室使用细胞培养污染物的新领域。早期的研究一般不用哺乳动物细胞培养副衣原体，但近来越来越多的实验证明副衣原体菌株能在多种细胞中存活。第一例报告是Berg17在Vero细胞中成功培养，但目前Bn9和Hall’s菌株在Vero细胞中尚未成功培养[5]。另外，Bn9菌株在McCoy细胞，P388D1巨噬细胞和人类胚胎成纤维细胞也未培养成功。以前认为胞内菌寄生物的宿主范围受棘阿米巴属限制，但近来研究表明副衣原体UV-7不受宿主UWE1的限制，可入侵哺乳动物细胞，如Vero，Hela和NCI-H292细胞。通过检测呼吸道标本16S rRNA基因序列获得的CorvenA4[6]，将其标本感染Vero和Hela细胞培养尚未有成功的报道。除此之外，副衣原体还可以感染人类肺泡壁细胞(A549)和肺成纤维细胞(HEL)，并在其中进行复制。

5 副衣原体分离培养

目前可以从环境样本和临床标本检测和分离获得PA。环境样本主要有土壤、活性淤泥、淡水、海水等。包括人类呼吸道标本、眼角膜组织、脑组织和皮肤病灶、粥样硬化斑块和外周血单个核细胞等[7]。

Gilbert[1]等证实目前分离阿米巴中的副衣原主要有两种方法。一是将临床标本直接在PAS(Page’s modified Neff’s amoeba saline)中培养，PAS是一种专门用于阿米巴培养的培养基，其特点是培养基中无营养成分，能抑制临床标本中污染物的过度生长。阿米巴最佳生长温度为30～35℃，需培养数天或几周，培养过程中需要定期检查有无阿米巴分解或Gimenez阳性球菌的出现。另一种方法是将临床标本接种至无营养琼脂培养基(100mlPAS培养液中加入1.5g琼脂)，再覆盖一层60℃热灭活1小时的大肠杆菌[8]，于25-30℃培养。

先前的PA的分离培养最大的缺点是费时[2]，近年来比较热门和实用的方法是采用共同培养的方法获得环境样本菌株。Astrid[2]等对工业废水治理工厂中的活性淤泥(activated sludge)与未感染副衣原体的棘阿米巴标准株UWE1进行共同培养，成功获得一株新的副衣原体命名为UV-7。经鉴定UV-7的16S rRNA序列与PA的同源性为98.7%。

6 副衣原体分离培养的影响因素

研究证实抗生素、温度和发病率等对副衣原体的分离培养有影响。Maurin[4]等发现PA对庆大霉素较为敏感，使用此氨基甙类抗生素有可能阻碍副衣原体的俘获。大环内酯类、四环素类抗生素及磺胺类药物等也会抑制副衣原体的生长，故不能在培养基中添加上述抗生素。另一方面，棘阿米巴对生长条件的耐受性远大于其它的阿米巴(如纳氏虫属阿米巴)，对温度要求也不严格，可在37℃左右很好的存活[7]，但是在培养含有胞内菌的棘阿米巴时，孵育期间的温度一般在32℃左右，高温下阿米巴非常容易形成囊胞，而且在大于32℃的时候副衣原体易诱导阿米巴发生溶胞[1]。冷冻可能会造成衣原体的活力丧失，但添加2%～10%胎牛血清可以减少失活率。

再者，虽然大量血清学和分子学研究证据证实副衣原体可引起吸入性肺炎和社区获得性肺炎，还可引起下呼吸道感染(细支气管炎和支气管炎)，但是同时也证实副衣原体DNA在支气管肺泡灌洗液标本中检测结果非常罕见(约为0.083%)。

7 结论与展望

目前迫切需要从临床标本和环境样本中成功分离培养出PA菌株及发现未知的且同源性较高的新种类。分离培养出PA菌株对进一步证实PA的致病性、致病机制、快速诊断等均具有十分重大的意义。寻找除共同培养方法、PCR检测16S rRNA基因特异性基因序列以外更好、更快捷的培养及检测方法。

[1]Greub G,Raoult D.Parachlamydiaceae:potential emerging pathogens.Emerg Infect Dis.2002 Jun,8(6):625-630.

[2]Greub G,Raoult D.Parachlamydiaceae:potential emerging pathogens.Emerg Infect Dis,2002,8(6):625-630.

[3]Corsaro D,Venditti D,Le Faou A,Guglielmetti P,Valassina M.A new chlamydia-like 16S rDNA sequence from a clinical sample.Microbiology,2001,147(Pt 3):515-516.

[4]Maurin,M.,A.Bryskier,and D.Raoult.2002.Antibiotic susceptibilities of Parachlamydia acanthamoebae in amoebae. Antimicrob.Agents Chemother.46:3065-3067.

[5]Greub G,Raoult D.Crescent bodies of Parachlamydia acanthamoeba and its life cycle within Acanthamoeba polyphaga:an electron micrograph study.Appl Environ Microbiol,2002,68(6):3076-3084.

[6]Casson N,Posfay-Barbe KM,Gervaix A,Greub G.New diagnostic real-time PCR for specific detection of Parachlamydia acanthamoebae DNA in clinical samples.J Clin Microbiol,2008,46(4):1491-1493.

[7]Schuster FL.Cultivation of pathogenic and opportunistic freeliving amebas.Clin Microbiol Rev.2002 Jul,15(3):342-354.

[8]Greub G,Desnues B,Raoult D,Mege JL.Lack of microbicidal response in human macrophages infected with Parachlamydia acanthamoebae.Microbes Infect,2005,7(4):714-719.

10.3969/j.issn.1009-4393.2010.14.022

421001 湖南省衡阳市南华大学病原生物学研究所 (黄新蓉 刘)