大肠杆菌细胞固定化方法研究进展

在过去的30多年，人们开发了多种原核和真核表达系统生产外源重组蛋白。和其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、表达水平高、操作容易和成本低等优点，成为表达外源蛋白最常用的表达系统之一。

近年来,随着固定化细胞技术的发展，越来越多的研究者关注于固定化大肠杆菌细胞。固定化大肠杆菌细胞具有如下优势：首先，相较于游离细胞，固定化细胞在催化反应过程中，其质粒更加稳定，目的基因产物的活力较高[1,2]，产物易于分离纯化；其次，和其它重组菌相比，大肠杆菌更易操作、发酵成本低、可快速大规模催化反应物转化为产物[3]。自1959年Hattori首次将大肠杆菌细胞吸附在树脂上实现了大肠杆菌细胞固定化以来，固定大肠杆菌活细胞或称为固定化增殖大肠杆菌细胞的研究工作相继展开。

目前，固定化重组大肠杆菌细胞已经广泛地应用于小分子药物生产、工业废水处理、能源开发以及大宗化学品生产等方面[4,5]。

1 大肠杆菌细胞固定化方法

从理论上讲，任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以用于大肠杆菌细胞的固定化。但目前使用最普遍的固定化大肠杆菌细胞的方法是包埋法和吸附法。

1.1 包埋法

包埋法的原理是将微生物细胞截流在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的网络空间中或埋于半透膜聚合物的超滤膜内，通过聚合作用、离子网络形成、沉淀作用，以及通过改变溶剂、温度、pH值来阻止细胞的泄漏，同时能让底物渗入和产物扩散出来。目前应用最为广泛的是凝胶包埋法固定大肠杆菌细胞，其特点如下[6]：

(1)操作简便。将大肠杆菌细胞与单体或聚合物一起聚凝，细胞被包埋在形成的聚合物中。

(2)条件温和。可选用不同的聚合物载体、不同的包埋系统和条件，以保持大肠杆菌的酶催化活性。

(3)稳定性好。大肠杆菌细胞不易渗漏。

(4)细胞容量高。大肠杆菌细胞在聚合体中含量可高达50%～70%。

(5)可以反复利用。与液体发酵相比，包埋的大肠杆菌生产周期短、产物分离方便、能耗低、设备投资少且可大大改善操作条件。

20世纪80年代末，赵景联[7]利用海藻酸钠包埋重组大肠杆菌细胞合成了高纯度的γ-氨基丁酸，间歇反应转化率可达100%。随后，由英才等[8]利用固定的大肠杆菌AS1.881合成了L-天门冬氨酸，固定化菌株在pH值9.0、40℃的条件下反应48 h，产物量达到最高。张晓梅等[9]通过固定化重组大肠杆菌JM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)发酵生产1,3-丙二醇，成功地克服了底物抑制作用，产率大幅提高。

包埋法的优点使其在大肠杆菌细胞固定化研究中占有较大的优势，但包埋法仍存在一些不足，如包埋材料对细胞的毒性作用、材料本身阻碍大分子底物和氧的扩散、使用过程中的杂菌污染等，这些还需要进行更深入的研究。

1.2 吸附法

吸附法又称载体结合法，是利用带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和粘附力等作用，而使微生物细胞固定在载体表面和内部的方法。该方法操作简单、大肠杆菌细胞活力损失小。

Torre等[10]分别利用多孔玻璃、网状聚氨酯、合成海绵吸附大肠杆菌JM109/pBB1催化阿魏酸盐合成香兰素，发现合成海绵吸附后，催化效果最好，香兰素的终浓度达到0.080 g·L-1，产率达0.019 g·L-1·h-1。

吸附法操作简单、成本较低，但所固定的大肠杆菌数目受所用载体的种类及其表面积的限制，并且大肠杆菌与载体作用力小，易脱落，只有通过与其它材料混合使用或者用交联剂进行交联，才能得到更广泛的应用。

2 大肠杆菌细胞固定化载体

理想的大肠杆菌细胞固定化载体应具备以下条件：机械强度高、寿命长、容量大、价格低、性质稳定、不易被生物降解、固定化过程简单、常温下易于成形；对于固定化活体细胞，固定化过程及固定化后对微生物无毒，生化及热力学稳定性好，基质通透性好，沉淀分离性好，具有惰性，不干扰生物分子的功能。此外，还要根据具体的使用环境，来选择大肠杆菌细胞固定化载体，或者优化载体性能。目前应用较多的大肠杆菌细胞固定化载体有葡聚糖类、海藻酸盐、聚丙烯酰胺和聚乙烯醇、无机载体等。

2.1 葡聚糖类

应用较广的葡聚糖类材料主要有琼脂糖凝胶、卡拉胶、黄原胶，它们的生物相容性良好，具有较大孔隙，可以允许高分子物质的扩散，并且不带电荷，不会与底物或产物形成离子键，不影响大肠杆菌生长，因此成为近年来研究最热门的固定化载体材料之一[11]。

童群义等[12]用PVA-卡拉胶混合载体固定化大肠杆菌-酵母菌混合体系生产谷胱甘肽，产率达446.7 mg·L-1，成功降低了生产成本，固定化细胞连续使用10批次，其酶活力无显著下降，也未见明显的膨胀和破碎。Trelles等[13]固定化EscherichiacoliBL21催化合成腺嘌呤和次黄嘌呤核苷，分别对比了海藻酸钠、琼脂、琼脂糖和聚丙烯酰胺包埋材料对产率的影响，发现在连续进行30批次反应后，相较于其它材料，固定在琼脂糖上的大肠杆菌细胞在前26批次反应均没有酶活损失；在相同的时间内，1 g琼脂糖固定化菌株能合成182 g腺苷，相当于73 g游离菌的产率；并且固定化大肠杆菌细胞在4℃存放6个月后酶活没有明显的下降。

但是葡聚糖类材料强度较低，容易溶胀、破碎，因此若要工业化应用，还需要在提高机械强度、改善力学性能等方面进一步探索，如与某些人工高分子材料混合使用，来提高其强度。

2.2 海藻酸盐

海藻酸盐是一种天然线性高聚物固定化介质，其二价以上的盐(Ca2+、Al3+) 为水不溶性盐，因此可形成耐热的凝胶，而且其易与蛋白质、明胶等多种物质共溶，并可与大肠杆菌混合形成均匀的悬浮液，具有机械性能较高、化学性质稳定、无毒、包埋效率高且价格低廉等优点，因此近年来应用广泛。

Lu等[14]用海藻酸钠固定化E.coliBL21-P450-BM3细胞，成功催化吲哚合成靛蓝，在pH值7.0、50℃时，合成靛蓝的活性达到了游离细胞的94%，并且固定化细胞重复使用6批次后，产率没有明显的下降。Birgisson等[15]用海藻酸钙固定化重组大肠杆菌细胞水解柚皮苷来生产α-L-鼠李糖，在50℃完全降解7.9 mmol·L-1的柚皮苷速率能达到1 mL·min-1，并且固定化细胞能连续使用3 d，第4 d降解能力下降10%～15%。牛卫宁等[16]用海藻酸钙包埋重组大肠杆菌E.coliJM109 (pBR322-MAT)细胞催化合成S-腺苷蛋氨酸，对比研究了聚乙烯醇和海藻酸钙的包埋效果，发现用海藻酸钙包埋重组大肠杆菌细胞合成S-腺苷蛋氨酸产率更高，包埋后小球的力学性能和传质效率较好。

然而在细胞生长所必需的高浓度磷酸盐和Mg2+、K+、Na+等阳离子溶液中，海藻酸钠与CaCl2形成的海藻酸钙凝胶小球不稳定，容易破碎和溶解，因此，近年来展开了对该载体的改性研究。海洪等[17]用聚乙烯亚胺溶液处理海藻酸钙凝胶，发现用聚乙烯亚胺-戊二醛交联和聚乙烯亚胺-高碘酸钠来强化凝胶颗粒，能提高其抗磷酸盐的能力和机械强度，并且酶活力没有变化，操作稳定性较好。

海藻酸盐作为一种无毒、低成本的固定化载体，随着其改性研究的深入，应用会更加广泛。

2.3 聚丙烯酰胺和聚乙烯醇

聚丙烯酰胺(PAM)由丙烯酰胺单体聚合而成，是一种水溶性线型高分子物质，具有良好的机械、化学和热稳定性能。Prabhune等[18]将具有青霉素酰基转移酶活性的大肠杆菌细胞固定于聚丙烯酰胺凝胶珠中，其水解活性显著提高，且在使用90批次后，其酶活也没有明显损失。但是由于交联过程中会放热，细胞在固定化过程中酶活损失很大，因此对大肠杆菌表达的重组酶选择性较高，使得其在大肠杆菌细胞的固定化中使用较少。

聚乙烯醇(PVA)是一种水溶性高分子聚合物,是目前国内外研究较为广泛的包埋固定化载体，其凝胶强度高、化学稳定性好、抗微生物降解性能强、毒性很小、细胞的活性损失小，具有很大的开发利用价值。Huang等[19]用含硼硅酚醛树脂PSB固定化E.coliATCC-11303细胞合成L-天冬氨酸，发现用聚乙烯亚胺处理的PSB固定化细胞后，细胞中L-天冬氨酸合成酶活性具有一定的特异性，而且底物的传输速率更快、凝胶强度更高，为L-天冬氨酸的大规模生产提供了更优越的条件。

由于PVA凝胶颗粒具有非常强的附聚倾向，不易制备成珠体，限制了其工业化应用。为了增强其传质和成球能力，需要在材料混合改性方面进行更深入的研究。

2.4 无机载体

多孔陶瓷、氧化铝、活性炭、微孔玻璃、高岭土、硅藻土等无机载体，大多具有多孔结构，可以利用其吸附作用和电荷效应将微生物或细胞固定。无机载体具有机械强度大、对细胞无毒性、不易被微生物降解、耐酸碱、成本低、寿命长等特性，是一类重要的吸附法固定化大肠杆菌细胞载体材料。

陈文谋等[20]用多孔陶瓷和浮石固定化重组大肠杆菌细胞合成β-葡聚糖，发酵液的酶活力分别达到97 U·mL-1和73 U·mL-1，比无载体液体发酵 (32 U·mL-1) 分别提高了3倍和2.3倍，并且固定化细胞具有良好的重复使用能力，在连续10批次实验后，多孔陶瓷和浮石固定化发酵液的酶活力分别不低于91 U·mL-1和71 U·mL-1。

由于菌株与无机材料之间的结合力弱，易脱落，用无机载体固定化的细胞不适宜在流化床中长时间参与催化反应，但可以利用无机载体孔隙大、传质容易等优点，将其与其它传质效果差的材料混合使用，以提高产率。

3 固定化大肠杆菌细胞的应用

近年来，随着固定化细胞技术的日趋成熟，一些固定化大肠杆菌细胞的研究成果已经应用于制药工业、环境保护、能源开发等领域。

3.1 小分子药物生产

很多小分子药物是利用重组大肠杆菌表达系统进行生产的，如果采用游离细胞发酵生产，存在产物分离纯化困难、不易操作、生产成本较高等缺点。如果将重组大肠杆菌进行固定化培养，可以简化目的产物的分离纯化步骤，生产成本大幅降低。

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)广泛存在于动植物和微生物中，是生物体内最重要的非蛋白巯基化合物之一，广泛用于治疗肝脏疾病、肿瘤、氧中毒、衰老和内分泌疾病。沈立新等[21]构建了重组E.coliBL21 (pTrc-gsh) 菌，利用卡拉胶固定化后催化合成谷胱甘肽，采用延缓甘氨酸加入的方法，控制GSH的合成分阶段进行，有效削弱了GSH的反馈抑制作用，GSH 的产率提高17.5%；在填充床中对催化合成GSH进行了考察，GSH合成量达1.24 g·L-1，比直接加入ATP提高24.2%。

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，是中枢神经系统中有效的抑制性神经递质，具有降血压、保持神经安定、改善脑机能、保肝护肾等作用。早在1883年γ-氨基丁酸就被人工合成。赵景联[7]用海藻酸钠固定化大肠杆菌细胞得到γ-氨基丁酸，并在间歇反应、连续搅拌式反应及连续柱式反应等扩大生产中获得了转化率达85%以上的γ-氨基丁酸。随后，沈俞等[22]又用卡拉胶与明胶复合载体固定化E.coli-AS1-505，结果表明,在卡拉胶与明胶质量比为1.5∶1时， 12 g·L-1的混合胶在60 g·L-1的 KCl溶液中固定化80 g·L-1的菌体，3 h后，酶活回收率最高；包埋量为100 g·L-1的固定化细胞重复反应7批次，可将40 g·L-1的底物完全转化为γ-氨基丁酸。

牛卫宁等[16]对固定化E.coliJM109(pBR322-MAT)催化合成S-腺苷蛋氨酸的大肠杆菌细胞固定化方法和材料、反应条件等进行了比较深入的研究。结果表明，采用2%海藻酸钙固定化细胞连续反应5批次后，固定化细胞酶活力为初始酶活力的91%；固定化细胞在35℃反应8 h，底物转化率超过95%。

3.2 废水处理

大肠杆菌细胞固定化技术以其微生物密度高、耐毒害能力强、微生物流失少、处理设备小型化等优点在废水处理领域中引起了普遍关注。

谢珊等[23]利用固定化基因工程菌E.coliBL21/pET2opd2b1处理有机磷混合农药废水，结果表明，固定化大肠杆菌细胞的降解速率与悬浮工程菌细胞相比有所降低，主要是受底物传质过程的限制和固定化过程对细胞活性的损害的影响，但固定化细胞比悬浮细胞有更高的比降解速率，工程菌细胞的稳定性较好(在50 d内活性保持良好)，而且与悬浮细胞相比，工程菌细胞不易流失，单位反应体积内的细胞密度增加了，工程菌细胞的耐毒害能力也大大增强，因此更适宜于实际废水处理和大规模应用。

万琼等[24]用固定化重组大肠杆菌细胞处理尿素厂废水，中试研究发现，反应21 h后，废水中总氮、氨氮和尿素的去除率可达90%以上，该法工艺简单经济，基本不产生污泥，对高浓度氨氮和有机氮有较强的抗抑制作用。

3.3 能源开发和化工原料的生产

由于化石燃料的燃烧已对全球环境造成严重污染，甚至对人类生存造成威胁。氢能作为理想的清洁能源之一，引起了人们的广泛重视。目前，氢气的工业化生产大都采用物化法，需要消耗大量的电能和矿物原料，生产成本过高，从而限制了氢能的发展。

Yokoi等[25]以葡萄糖为底物对产气肠杆菌E.aerogenesHO-39菌株进行的非固定化实验中，产氢速率仅为120 mL·L-1·h-1；采用多孔玻璃作为载体对菌体细胞进行固定化后，产氢速率提高到850 mL·L-1·h-1，较非固定化细胞产氢速率提高了7倍。

Chittibabu等[26]构建了重组菌E.cloacaeIIT-BT-08，并对其进行固定化，产氢量较野生型菌株提高了3.12 mol·(mol葡萄糖)-1，最高产氢速率为66 mmol·h-1，而相同条件下游离菌催化产氢速率仅为0.55 mmol·h-1。

1,3-丙二醇(1,3-Propanediol,1,3-PD)是一种重要的溶剂和化工原料。为了得到高产量的1,3-PD，张晓梅等[9]构建了工程菌JM109 (pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)，在最适培养条件下，1,3-PD的产量和生产能力分别达到43.1 g·L-1和1.54 g·L-1·h-1；将该菌细胞用海藻酸钙固定化后，细胞对底物甘油和产物1,3-PD的耐受力有了明显的提高，1,3-PD产量、转化率及生产能力分别可达61.5 g·L-1、76.8%和2.57 g·L-1·h-1。

4 结语

大肠杆菌表达系统已经成为表达外源蛋白最常用的表达系统之一，而固定化大肠杆菌细胞因操作简单、成本低廉等优点在工业化生产中具有广泛的应用前景。

大肠杆菌细胞固定化技术还需要在以下方面进行更深入的研究：(1)利用磁性聚合物微球、超临界技术、纳米技术等改进大肠杆菌细胞固定化方法。(2)寻找价廉、半衰期长、底物易于扩散、对大肠杆菌细胞毒性小的固定化载体材料，进一步研究混合使用各种材料，令材料间优势互补。(3)对大肠杆菌催化反应机理及动力学进行更深入的研究，完善高效的固定化反应工艺，使其满足大型化、自动化和连续化生产的需要，充分体现固定化细胞生物反应器的优势。(4)在多种菌株共生的固定化体系以及生物再生技术方面也有待更深入研究。

参考文献：

[1] 孙进,吴梧桐. 基因工程菌固定化研究进展[J].药物生物技术, 1999, 6(4):249-254.

[2] Chen X A, Xu Z N, Cen P L, et al. Enhanced plasmid stability and production of hEGF by immobilized recombinantE.coliJM101[J]. Biochemical Engineering Journal, 2006, 28(3):215-219.

[3] Junter G A, Jouenne T. Immobilized viable microbial cells: From the process to the proteome em leader or the cart before the horse[J]. Biotechnology Advances, 2004,22(8):633-658.

[4] Murata K, Kimura A. Overproduction of glutathione and its derivatives by genetically engineered microbial cells[J]. Biotechnology Advances,1990, 8(1):59-96.

[5] Das D. Advances in biohydrogen production processes: An approach towards commercialization[J]. International Journal of Hydrogen Energy,2009,34(17): 7349-7357.

[6] 肖美燕,徐尔尼,陈志文. 包埋法固定化细胞技术的研究进展[J].食品科学,2003,24(4):158-161.

[7] 赵景联.固定化大肠杆菌细胞生产γ-氨基丁酸的研究[J].生物工程学报,1989,5(2):124-128.

[8] 由英才,王寿亭,王补森,等. 用海藻酸钠固定化大肠杆菌AS1.881合成L-天门冬氨酸[J].离子交换与吸附,1992,8(1): 1-4.

[9] 张晓梅,诸葛健. 固定化重组大肠杆菌产1,3-丙二醇发酵条件的研究[J]. 食品与发酵工业,2007,33(3):23-26.

[10] Torre P, Faveri D D, Peregeo P, et al. Bioconversion of ferulate into vanillin byEscherichiacolistrain JM109/pBB1 in an immobilized-cell reactor[J]. Annals of Microbiology, 2004,54(4):517-527.

[11] 陈巍,何小维,李忠彦,等.天然多糖在细胞固定化载体材料中的应用进展[J].酿酒科技,2006,(11):90-93.

[12] 童群义,陈坚,堵国成,等.PVA-卡拉胶混合载体固定化大肠杆菌-酵母菌混合体系生产谷胱甘肽[J]. 工业微生物,2000,30(4):1-5.

[13] Trelles J A, Bentancor L, Schoijet A,et al. ImmobilizedEscherichiacoliBL21 as a catalyst for the synthesis of adenine and hypoxanthine nucleosides[J]. Chemistry and Biodiversity, 2004,1(2):280-288.

[14] Lu Y, Mei L H. Production of indigo by immobilization ofE.coliBL21 (DE3) cells in calcium-alginate gel capsules[J]. Chin J Chem Eng, 2007,15(3):387-390.

[15] Birgisson H, Wheat J O, Hreggvidsson G O,et al. Immobilization of a recombinantEscherichiacoliproducing a thermostableα-L-rhamnosidase: Creation of a bioreactor for hydrolyses of naringin[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 40(5):1181-1187.

[16] 牛卫宁,左晓佳,尚晓娅,等.固定化E.coliJM109(pBR322-MAT)细胞催化合成S-腺苷蛋氨酸[J].现代化工,2009,29(3):38-41,43.

[17] 海洪,杨根敏,顾璆. 聚乙烯亚胺对海藻酸固定化大肠杆菌细胞的强化作用[J]. 中国抗生素杂志,1990,15(6):451-453.

[18] Prabhune A A, Rao B S, Pundle A V,et al. Immobilization of permeabilizedEscherichiacolicells with penicillin acylase activity[J]. Enzyme and Microbial Technology,1992,14(2):161-163.

[19] Huang J, Jin N, Katsuda T, et al. Immobilization ofEscherichiacolicells using polyethyleneimine-coated porous support particles for L-aspartic acid production [J]. Biochemical Engineering Journal, 2009, 46(1):65-68.

[20] 陈文谋,卢英华,李清彪,等. 多孔陶瓷和浮石载体固定化重组大肠杆菌表达β-葡聚糖酶[J].厦门大学学报(自然科学版),2007,46(1):77-81.

[21] 沈立新,魏东芝,尧辉. 重组大肠杆菌催化合成谷胱甘肽的研究[J].西北大学学报(自然科学版),2003,33(5):554-557.

[22] 沈俞,刘均忠,刘茜,等. 复合载体固定化大肠杆菌制备γ-氨基丁酸[J].精细化工,2008,25(5):459-462,510.

[23] 谢珊,刘俊新,李琳,等. 利用基因工程菌BL21处理有机磷混合农药废水的研究[J].环境工程学报,2008,2(7):869-874.

[24] 万琼,叶正芳,魏东洋,等. 固定化生物流化床处理尿素厂废水的中试研究[J].给水排水,2006,32(8):44-47.

[25] Yokoi H, Tokushige T, Hirose J, et al. Hydrogen production by immobilized cells of aciduricEnterobacteraerogenesstrain HO-39[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering,1997, 83(5):481-484.

[26] Chittibabu G, Nath K, Das D. Feasibility studies on the fermentative hydrogen production by recombinantEscherichiacoliBL-21[J].Process Biochemistry,2006, 41(3):682-688.