血浆必需氨基酸浓度与细胞自噬程度相关性分析

王慧俐, 邱 龄, 李艳芳 (山西医科大学第二临床医学院心内科, 太原 030001)

细胞自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象,是生物在其发育、老化过程中都存在的一个净化自身多余或受损细胞器的共同机制,这一过程在细胞清除废物、结构重建、生长发育中起重要作用[1]。自噬的消长受多因素的影响,饥饿、胰高血糖素可以诱导自噬;胰岛素抑制自噬。他们的作用点在于影响血浆氨基酸的水平,当氨基酸水平降低时自噬启动,相反自噬被抑制[2]。但不同氨基酸对细胞自噬程度的影响,目前国内外相关文献较少。本实验采用定期饥饿大鼠诱导自噬,一定时期后检测血浆必需氨基酸浓度和肝脏细胞自噬程度做相关性分析,以探讨哪些血浆必需氨基酸的浓度与细胞自噬程度相关性大,为今后诱导或抑制细胞自噬的研究提供实验基础,为细胞自噬在临床中的应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂 Agilent 1200高效液相色谱系统,包括四元泵、脱气机、自动进样器、紫外检测器、柱温箱,HP化学工作站;透射式电镜(日本日立 HITACHI公司 H-600);超薄切片机(瑞典 LKB公司LKB-Ⅴ )。

8种氨基酸标准品[苏氨酸 (Thr)、色氨酸(Trp)、异亮氨酸 (Ile)、亮氨酸 (Leu)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸 (Met)、苯丙氨酸 (Phe)、赖氨酸(Lys)]购自 Sigma公司;甲醇、乙腈为 HPLC,三乙胺、四氢呋喃、醋酸钠均为分析纯,购自天津市北联精细化学品开发有限公司;硼酸、邻苯二甲醛、巯基乙醇(上海生工生物工程技术有限公司进口分装);24月龄 SD雌性大鼠,体重 320-470g(山西医科大学动物实验中心)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组及取材 大鼠 30只自由饮食洗脱2周,饲料为全价颗粒料(主要营养成分:粗蛋白19.31%、粗脂肪 2.9%、粗纤维 3.1%、水分 8.7%、钙 0.5%、磷 0.5%),2周后按体重随机分为 A组(正常饮食对照组)、B组(1 d自由饮食 1 d禁食)、C组(5 d自由饮食 2 d禁食)3组(每组 10只)。普通环境饲养,饲料同上,温度 20-24℃,湿度55%-80%,自然光照,饮用自来水,每周换垫料 2次。饲养 5个月后,于 B组和 C组均应禁食当天清晨取标本。25%的乌拉坦麻醉大鼠后暴露肝脏,快速剪下一小块肝脏组织在预冷的固定液30 s内切成1 mm3大小的组织块,置于 2%的戊二醛固定液 2 h后缓冲液冲洗后浸泡,4℃保存备用。垂直心脏进针采血 2 m l,抗凝后室温静置 10min,采用离心机加速红细胞沉淀(3 000 r/min,15min),取 500μl上清液加入等体积乙腈混匀室温静置 10 min充分沉淀血浆中的蛋白质,然后 15 000 r/min离心 10 min,取上清液,-70℃保存待测。

1.2.2 高效液相色谱法检测血浆氨基酸含量

1.2.2.1 氨基酸标准品储备液制备 用 0.1 mol/L的 HCl制成含每种氨基酸浓度为 0.125,0.25,1.25,2.5μmol/m l的 4种混合氨基酸储备液,4℃冰箱保存。

1.2.2.2 邻苯二甲醛(OPA)衍生试剂的制备20mg OPA以 5ml甲醇溶解,加入 50μl巯基乙醇,混匀,4℃冰箱保存,3 d内使用。

1.2.2.3 色谱条件 SinoChrom ODS-BPC18色谱柱(5μm,250 mm×4.6mm,大连伊利特公司);流动相 A液为 0.02mol/L醋酸钠(pH7.2)-四氢呋喃-三乙胺(99∶1∶0.1),流动相 B为甲醇-乙腈-0.02 mol/L醋酸钠(pH 7.2)(175∶225∶100);梯度程序以纯 A液开始,递增 B液百分比,具体增幅如下:0 min,100%A;17 min,50%B;19 min,50%B;21 min,100%B;21.5 min,100%B;22 min,100%A。流速1.0ml/min;检测波长 338 nm,柱温 25℃。

1.2.2.4 测定 取不同浓度氨基酸标准品 20μl,加 OPA试剂 40μl,硼酸缓冲液(pH 8.5)180μl,充分混匀后,室温进行衍生化反应 10min后,0.45μm滤过膜滤过取 20μl进样。以标准氨基酸浓度对峰面积作为标准曲线,得出 8种氨基酸的线性回归方程,以此对未知样品定量分析。依上述方法对各种血浆样品逐一测定,经线性方程计算得出样品中各种氨基酸的含量。

1.2.3 透射电镜观察肝细胞自噬泡 经过常规取材、双重固定、脱水、浸透、包埋、切片(厚度为 50 nm)、醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色后,透射电镜观察、拍照、记录。采用 Image-Pro Plus6.0软件计算电镜照片中各个细胞中自噬泡占细胞质总面积的比例。

2 结果

2.1 大鼠血浆氨基酸测定

2.1.1 氨基酸类型的确定 采用高效液相色谱法检测血浆氨基酸含量结果见图 1。

2.1.2 氨基酸的浓度 B组和 C组中的缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和赖氨酸的浓度较 A组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01),两组之间比较差异无统计学意义。其他氨基酸三组间比较差异均无统计学意义(见表1)。

2.2 细胞自噬的检测

2.2.1 电镜观察 A组肝脏细胞核内染色质分布均匀,核仁明显;脂滴较多,线粒体嵴结构清晰,粗面内质网分布在细胞质,自噬溶酶体少见。B组肝脏细胞核内染色体轻度凝集、边聚,核仁可见,细胞质内线粒体丰富,肿胀明显,内质网轻度扩张,自噬溶酶体数量较多。C组肝脏细胞核圆形,核内染色质轻度边聚,线粒体丰富,线粒体轻度肿胀,内质网轻度扩张,自噬溶酶体较多。自噬泡为单层或双层膜包裹着的处于不同降解阶段的胞质成分或废弃的细胞器经消化降解后形成的板层样结构 (见图2)。

图1 8种必需氨基酸的 HPLC图谱(0.25μmol/ml)Fig 1 HPLC chromatograms of essential amino acids(0.25μmol/m l)

表1 不同组大鼠血浆必需氨基酸含量 (±s,n=10,nmol/ml)Tab 1 Contents of essential am ino acids in rat serum in different groups

表1 不同组大鼠血浆必需氨基酸含量 (±s,n=10,nmol/ml)Tab 1 Contents of essential am ino acids in rat serum in different groups

与 A组比较,*P＜0.01,**P＜0.001

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图2 各组大鼠肝脏细胞自噬透射电镜观察及典型自噬泡Fig 2 The autophagy of rat hepatocytes and the typicalautophagosomes under TEM

2.2.2 自噬泡占细胞质总面积的比值 经 Image-Pro Plus6.0软件计算各组细胞电镜照片中自噬泡占胞质总面积的比值,结果显示:B组(0.029 2±0.018 8)和 C组 (0.045 2±0.019 6)均较 A组(0.008 9±0.004 1)明显增加,差异有统计学意义(P＜0.01);B组和 C组两者之间该比值无统计学差异(P＞0.05)。

2.3 血浆氨基酸浓度与细胞自噬程度的关系 采用 Spearman秩相关计算血浆氨基酸浓度和自噬泡占细胞质总面积的比值的相关性,结果显示缬氨酸与细胞自噬相关性最大(r=-0.779,P＜0.01),赖氨酸相关性最小(r=-0.517,P＜0.01),苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸与细胞自噬的相关系数分别为-0.566,-0.527和 -0.531,均 P＜0.01。其余氨基酸与细胞自噬无相关性。

3 讨论

细胞自噬是生物在发育、老化过程中存在的一个净化自身受损蛋白质或细胞器的机制,贯穿于正常细胞生长发育和生理病理过程,对于维持蛋白质代谢平衡及细胞内环境稳定起重要的作用,在防止神经退行性病变、肿瘤、病原微生物感染等疾病及延长寿命起积极作用[3],因此对细胞自噬作用的研究不仅有理论意义也具有重要的应用价值。

随着年龄的增加自噬功能下降造成异常蛋白质、DNA以及细胞器进行性的积聚,这些积聚的蛋白质分子是老化与许多急、慢性疾病的主要病因[2]。在大鼠长期的刺激自噬可延缓衰老[4]。肿瘤细胞中自噬能力明显低于正常细胞,因其对血浆氨基酸降低或高细胞密度等因素反应迟钝[5]。可见对自噬诱导或抑制的研究具有重要的意义。细胞自噬信号的调控目前研究较多的是 mTOR信号途径[2]。TOR激酶是氨基酸、ATP和激素的感受器,对细胞生长具有重要调节作用,抑制自噬的发生,是自噬的负调控分子[6]。自噬的消长受多因素的影响[7],饥饿(尤其是氨基酸减少)、胰高血糖素可以诱导自噬;胰岛素抑制自噬。他们的作用点在于影响血浆氨基酸的浓度,当氨基酸浓度降低时,自噬启动;相反自噬被抑制[2,4]。细胞自噬活性随年龄增加而下降,这种下降可能与年龄相关的消化吸收后氨基酸水平的增加和/或基础水平胰岛素受体信号传导途径的增加有关[8]。推断当氨基酸水平升高时激活 TOR激酶抑制了自噬的发生,相反则激活自噬[4]。由此可见血浆氨基酸水平和细胞自噬的程度密切相关,探讨从血浆氨基酸水平调节细胞自噬程度的研究目前国内外较少。

本实验采用两种不同的禁食方式使大鼠定期处于饥饿状态,经过一段时间干预后检测大鼠血浆中必需氨基酸的浓度,结果显示两干预组中缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和赖氨酸的浓度较对照组明显降低,差异有统计学意义,而两组之间比较差异无统计学意义,其余必需氨基酸三组间比较差异均无统计学意义。计算自噬泡占胞质总面积的比值显示两干预组的该比值明显大于对照组,差异有统计学意义,而两组之间比较差异无统计学意义。由此可见与正常饮食对照组相比,两干预组中缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和赖氨酸的浓度均明显降低,细胞自噬程度均明显增强。但两种不同的禁食方式对该结果的影响无统计学差异。相关性分析显示缬氨酸浓度与细胞自噬程度的相关性最大,赖氨酸的相关性最小,苯丙氨酸、蛋氨酸和亮氨酸的浓度与细胞自噬程度相关系数介于二者之间。通过实验我们可知定期饥饿可降低某些血浆必需氨基酸浓度和增强细胞发生自体吞噬的程度,相关性分析显示这些必需氨基酸的浓度和细胞自噬的程度呈负相关,其中缬氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和赖氨酸的浓度对细胞自噬的程度影响较大,实验采用的两种不同禁食方式对血浆氨基酸及细胞自噬的影响无明显的统计学差异。我们推测通过调节血浆氨基酸的水平来调控细胞自噬将是细胞自噬在临床应用中的一个方向。低血浆氨基酸水平是否通过抑制 TOR激酶激活了 mTOR信号途径进而增强了细胞发生自体吞噬及其相应的细胞机制和非必需氨基酸对细胞自噬的影响等将有待于进一步研究。

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