青海省部分地区牛奶中几种微生物指标的检测

李桂兰

（青海省动物疫病预防控制中心，青海 西宁 810006）

牛奶安全关系到消费者的身体健康，影响牛奶安全的因素较多，须对其进行全面的检测，检测项目主要包括微生物检测、化学物质检测、残渣检测等。当乳牛受到饲养管理、疾病、气温以及其他各种因素（包括人工造假）的影响时，乳的成分和性质往往发生变化，这种乳不适于加工优质的产品，极可能对消费者造成健康隐患，所以必须对奶制品进行检测[1]。牛奶安全的检测对保证使用者的健康有着非常重要的意义。

微生物的污染是引起乳及乳制品变质的重要原因。在乳及乳制品加工过程中的各个环节如灭菌、过滤、浓缩、发酵、干燥、包装等，都可能因为不按操作规程生产加工而造成微生物污染。所以在乳及乳制品的加工过程中，对所有接触到乳及乳制品的容器、设备、管道、工具、包装材料等都要进行彻底的灭菌，防止微生物的污染，以保证产品质量[2]。另外在加工过程中还要防止机械杂质和挥发性物质(如汽油)等的混入和污染。原料乳卫生质量的优劣直接关系到乳及乳制品的质量。原料的卫生质量问题主要是病牛乳(结核病、乳房炎牛的乳)、高酸乳、胎乳、初乳，应用抗生素五天内的乳、掺伪乳以及变质乳等。

1 材料与方法

1.1 检测方法

1.1.1 检测方法

本检测方法均按中华人民共和国国家标准《食品卫生微生物学检验》GB/T4789-2003中《食品卫生微生物学检验》GB/T4789.2-2003《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》，GB/T4789.3-2003《食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定》，GB/T 4789.4-2003《食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验》要求检验方法进行检验。

1.1.2 检测项目

检验项目为细菌总数、大肠菌群和沙门氏菌。

1.2 材料

1.2.1 样品

青海省部分地区8批次70份鲜牛奶样品。

1.2.2 器械[3]

0℃～4℃冰箱，36℃±1℃恒温培养箱，46℃±1℃恒温水浴锅，均质器或灭菌乳钵，0g～500g架盘药物天平，菌落计数器，4×放大镜，10×～100×显微镜，1mL（具 0.01mL刻度）、10mL（具0.01mL刻度）灭菌吸管，500mL灭菌锥形瓶，直径5mm灭菌玻璃珠，直径90mm灭菌培养皿，16mm×160mm灭菌试管，3mm×50mm灭菌小试管，灭菌毛细管、刀、剪子、镊子等。

1.2.3 培养基和试剂

1.2.3.1 菌落总数测定

营养琼脂培养基；硫酸盐缓冲液；0.85%灭菌生理盐水；75%乙醇。

1.2.3.2 大肠菌群测定

乳糖胆盐发酵管，伊红美兰琼脂平板，乳糖发酵管，EC肉汤；革兰氏染色液。

1.2.3.3 沙门氏菌测定

缓冲蛋白胨水（BP），氯化镁孔雀绿（MM）增菌液，四硫酸钠煌绿（TTB）增菌液，亚硫酸盐胱氨酸（CC）增菌液，亚硫酸铋琼脂（BS），DHL琼脂，HE琼脂，WS琼脂，SS琼脂，三糖铁琼脂，蛋白胨水、定基质试剂，尿素琼脂（pH7.2），氰化钾（KCN）培养基，氨基酸脱羧酶试验培养基，糖发酵管，ONPG培养基，半固体琼脂，丙二酸钠培养基。沙门氏菌因子血清：按26种用于初步分型；57种用于进一步分型；163种用于详细分型。

1.3 方法[3]

1.3.1 菌落总数测定方法

1.3.1.1 以无菌操作将检样25mL放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇做成1:10的均匀稀释液。

1.3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1:100的稀释液。

1.3.1.3 另取1mL灭菌吸管，按上调操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。

1.3.1.4 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2个～3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿。

1.3.1.5 稀释液移入培养皿后，及时将凉至46℃营养琼脂培养基（可放置于46℃±1℃水浴恒保温）注入培养皿约15mL，并转动培养皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液灭菌培养皿内做空白对照。

1.3.1.6 待琼脂凝固后，翻转平板，置36℃±1℃温箱内培养48h±2h。

1.3.1.7 菌落计数方法

做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。

1.3.2 大肠菌群测定方法

1.3.2.1 以无菌操作将检样25mL放于含有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振摇做成1:10的均匀稀释液[4]。

1.3.2.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇试管，混合均匀，做成1:100的稀释液。

1.3.2.3 另取1mL灭菌吸管，按上调操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。

1.3.2.4 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择3个适宜稀释度，每个稀释度，接种3管。

（1）乳糖发酵试验

将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置36℃±1℃温箱内，培养18h～24h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

（2）分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，置36℃±1℃温箱内，培养48h±2h，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。

在上述平板上，挑取可疑大肠菌群1个～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖胆盐发酵管，置36℃±1℃温箱内，培养24h±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

1.3.3 沙门氏菌测定方法

1.3.3.1 前增菌和增菌

以无菌操作取25mL，加在装有225mL缓冲蛋白胨水的广口瓶内。移取10mL，转于100mL氯化镁孔雀绿增菌液内，于42℃培养18h～24h。同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36℃±1℃培养 18h～24h。

1.3.3.2 分离

取增菌液一环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板。两种细菌液可同时划线接种在同一个平板上。于36℃±1℃分别培养18h～24h，观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙门氏菌Ⅲ在各个平板上的菌落特征见表1。

1.3.3.3 生化试验

自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂内，肠杆菌科常见属种的反应结果见表2。

表2说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢（H2S）阴性的菌株可以排除，其他的反应均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能。

2 结果

2.1 评价标准

评价按照《食品卫生国家标准》进行评价。凡样品中有一项或一项以上指标不符合标准则定为不合格样品。

?

?

2.2 检测结果

8批次70份鲜牛奶检测中菌落总数 (Cfu／mL)介于 6.3×104与3.6×105之间，平均为 1.4×105；大肠菌群(MPN／100mL)是 1.5×104与1.4×105之间，平均为 7.6×104，均低于国标 GB/T4789.1～4789.31—2003的要求（菌落总数：5.0×105，大肠菌群：1.0×105）。沙门氏菌检测均为阴性。详见表3。

?

3 讨论

3.1 2008年的三聚氰胺事件，包括三鹿奶粉在内的国内其他名牌产品都存在类似问题，建议除了加强对三聚氰胺等化学添加剂的监测外，还需加强对病原微生物监测。

3.2 虽然整体平均符合国标要求，但是部分批次的单个样品有超标的情况，这可能与以下几个方面有关，一是养殖环境较差，病原微生物滋生导致。二是挤奶环节没有按照规定操作，比如挤奶前没有对乳头进行清洗消毒，致使粪便污染乳头所致；盛奶容器消毒达不到要求。三是个别奶牛存在隐性乳房炎，导致鲜奶质量不符合要求。四是虽然部分企业开始集约化养殖，但是其管理模式尚与蒙牛、伊利等大型企业存在较大差距，尤其在龙头带动农户的模式中存在监管不力，质量难以控制的情况。

3.3 本实验按照GB/T4789.2—2003食品微生物学检验完成，该规范在鲜奶微生物检测中存在规范不清、没有具体判定数值标准等情况，建议国家有关部门提出针对鲜乳中微生物检验的相应国家标准和规范。

3.4 建议我省奶牛养殖中提高规模化和规范化养殖水平，并提高动物防疫水平；与此同时建议动物卫生监督部门和动物防疫部门加强市场检疫和源头检测，整体上提高我省鲜奶质量，进而全面提高我省该方面食品安全水平。

3.5 加强宣传力度，大力宣传食品卫生相关知识，强化广大人民群众的食品卫生安全意识，从而逐步努力营造人人参与食品安全、全社会重视支持食品安全的良好氛围，让消费者喝上安全卫生的牛奶制品。

3.6 青海地区幅员辽阔，是全国五大牧区之一，畜牧业在青海有广阔的发展前景，而奶业在全省有独特的优势。把优势转化为发展经济的亮点，就要求奶业从事者从基础抓起，确保乳制品的质量过关。广大的质量监督员也要履行本职工作，为奶业经济把好关。乳制品质量检测任重道远，相关检测技术亟待发展进步。

[1]张彦明，佘锐萍.动物性食品卫生学[M].3版.北京:中国农业出版社，2007.

[2]张建新.食品质量安全技术标准法规应用指南[M].北京:科学技术文献出版社，2002.

[3]GB/T4789.2－2003食品卫生微生物学检验菌落总数测定[S].北京：中国标准出版社，2003.

[4]张彦明，贾靖国.动物性食品卫生检验技术[M].西安:西北大学出版社，1995.

[5]郭本恒.现代乳品加工学[M].北京:中国轻工业出版社，2001.

[6]于莉，罗章，孟云.西藏地区牦牛乳理化和微生物指标的检测分析[J].中国乳品工业，2006，34(9):108-111.

[7]蔺长明，王占江，李振举.无公害畜禽产品的生产和认证[J].中国动物检疫，2003，20（7）：1-2.

[8]李莎燕，马文瑞，褚明德.门源县奶牛养殖业的现状与发展对策[J].青海畜牧兽医杂 志，2008，38（5）:37-38.

[9]阎萍，潘和平.牦牛乳业的开发和利用[J].中国乳业，2004(7):10-121.

[10]李万财，尚海忠，李俊花，等.天峻地区牦牛乳中微生物含量的测定[J].中国动物检疫，2002，19(3):361.

[11]张福年.民和县奶牛生产的现状及对策 [J].青海畜牧兽医杂志，2008，38（5）:39-40.