复方苦芩软膏质量标准研究

张 沂，王 强，蔡清宇，任婷麟，于春令，郝 特，吴 迪

（海军总医院药剂科，北京市 100048）

复方苦芩软膏是我院药剂科自主研制的外用乳膏剂，具有消炎、镇痛、抗变态反应及保护创面、润滑皮肤的作用，临床用于海洋生物蛰伤、蚊虫咬伤等症的治疗。为了保证制剂质量，笔者采用薄层色谱（TLC）法对软膏中芦荟苷、黄芩苷、薄荷脑3种成分进行定性鉴别；用高效液相色谱（HPLC）法在同条件下，测定该制剂中有效成分延胡索乙素、黄芩苷的含量。本法具有方便快捷、准确和重复性好的特点，可作为该制剂的质量控制标准。

1 材料

1.1 仪器

LC-10A HPLC仪，包括LC-10AD泵、CTO-10A柱温箱、CLASS-VP工作站（日本岛津公司）；AT-261型万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Telode公司）；ME-2155型十万分之一电子分析天平（德国Suiropras公司）；KQ-300E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DGG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；CX41型扫描电镜（日本Olympus公司）。

1.2 试药

复方苦芩软膏（规格：每支15 g，批号：090625、090702、090728）及阴性样品由海军总医院提供；延胡索乙素（批号：110726-200610）、黄芩苷（批号：110715-200815）、芦荟苷（批号：110787-200303）、苦参碱（批号：110805-200507）、薄荷脑（批号：110728-200506）对照品均购自中国药品生物制品检定所；乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 芦荟苷的TLC鉴别 取本品1 g，加无水乙醇30 mL，超声30 min，滤过，挥干，加无水乙醇5 mL使溶解，作为供试品溶液；另取芦荟苷[1]对照品，加无水乙醇制成每1 mL含5 mg的溶液，作为对照品溶液。照TLC法[2]试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%氢氧化钾甲醇溶液，在365 nm紫外灯光下检视。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。芦荟苷的TLC见图1。

2.1.2 黄芩苷的TLC鉴别 取本品1 g，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1）混合液30 mL，超声30 min，滤过，蒸干，加无水乙醇5 mL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芩苷[3]对照品，加无水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液、对照品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。黄芩苷的TLC见图2。

图1 芦荟苷的TLC1～3.供试品；4.阴性对照；5.芦荟苷对照品Fig 1 TLC of alion1～3.test sample；4.negative control；5.alion control

2.1.3 薄荷脑的TLC鉴别 取“2.1.1”项下的供试品溶液为供试品溶液；另取薄荷脑[4]对照品，加无水乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液、对照品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯（85∶15）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。薄荷脑的TLC见图3。

图2 黄芩苷的TLC1～3.供试品；4.黄芩苷对照品；5.阴性对照Fig 2 TLC of baicalin1～3.test sample；4.baicalin control；5.negative control

图3 薄荷脑的TLC1～3.供试品；4.薄荷脑对照品；5.阴性对照Fig 3 TLC of menthol1～3.test sample；4.menthol control；5.negative control

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbox Edipse-XDB C18（150 mm×4.6 mm，5µm）；柱温：40℃；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：280 nm；进样量：5µL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取延胡索乙素对照品，加95%乙醇制成每1 mL含0.131 mg的溶液，即得延胡索乙素对照品溶液；精密称取黄芩苷对照品，加95%乙醇制成每1 mL含0.1007 mg的溶液，即得黄芩苷对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品适量，混匀，取约0.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入95%乙醇溶液100 mL，称重，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）15 min，用95%乙醇补足失重，样品冷浸12 h后，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 空白试验 按处方中药的比例，按“2.2.3”项下方法制备不含延胡索乙素及黄芩苷的阴性对照溶液，并按上述方法进行测定。结果，在延胡索乙素及黄芩苷的色谱峰处均未发现吸收峰，表明无干扰。色谱见图4。

图4 高效液相色谱图A.延胡索乙素对照品；B.黄芩苷对照品；C.供试品；D.阴性对照；1.延胡索乙素；2.黄芩苷Fig 4 HPLC chromatogramsA.tetrahydropalmatine control；B.baicalin control；C.test samples；D.negative control；1.tetrahydropalmatine；2.baicalin

2.2.5 线性关系考察 （1）精密称取延胡索乙素对照品适量，加95%乙醇制成每1 mL含0.655 mg的溶液，作为对照品贮备液。分别精密量取对照品贮备液0.4、0.8、1.2、2.0、4.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，加95%乙醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取对照品溶液各5 μL，注入HPLC仪，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，延胡索乙素进样量（X，μg）为横坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y＝921919X+9609.1（r＝0.9999）。结果表明，延胡索乙素进样量在0.131～3.275 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。（2）精密称取黄芩苷对照品适量，加95%乙醇制成每1 mL含1.007mg的溶液，作为对照品贮备液。分别精密量取对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，置10 mL量瓶中，加95%乙醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取对照品溶液各5 μL，注入HPLC仪，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，黄芩苷进样量（X，μg）为横坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y＝3000000X－33326（r＝0.9999）。结果表明，黄芩苷进样量在0.05035～2.014 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.2.6 稳定性试验 取本品（批号：090728），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件于0、2、4、6、8、10 h进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量。结果，延胡索乙素的RSD＝0.38%，黄芩苷的RSD＝0.15%，表明供试品溶液在10 h内稳定，本方法有良好的稳定性。

2.2.7 重复性试验 取样品（批号：090728），按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，测定其含量。结果，延胡索乙素的RSD＝0.97%，黄芩苷的RSD＝2.00%，表明方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取已知含量的样品（批号090728，延胡索乙素含量：17.91mg·g-1，黄芩苷含量：19.00 mg·g-1）约2.500 g（6份），精密称定，分别精密加入延胡索乙素对照品及黄芩苷对照品溶液适量，按供试品溶液的制备方法操作，测定含量，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.2.9 样品含量测定 依“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，依相同色谱条件，以外标法计算3批样品（批号：090625、090702、090728）的含量，结果见表2。

表2 样品中延胡索乙素及黄芩苷含量测定结果（n＝3）Tab 2 Content determination of tetrahydropalmatine and baicalin in samples（n＝3）

3 讨论

3.1 关于TLC鉴别

在本次复方苦芩软膏的质量标准研究过程中，经多方资料查询及反复试验筛选研究，选出上述几种无干扰且重复性好的药味鉴别，且提取和鉴别方法均简便有效。经多批样品验证，均能检出与对照品相同的斑点，在TLC方面为本制剂提供了比较全面准确的质量控制方法。其中，芦荟苷易氧化，供试品制备后应尽快点样鉴别。

3.2 前处理条件的选择

试验中在对溶剂的选择上，比较了甲醇和95%乙醇、95%乙醇冷浸12 h的处理效果。结果表明，3种方法的效果差别不大，但乙醇的毒性小，且冷浸后能更好地将乳膏中的基质除去，故选择95%乙醇冷浸12 h的处理方法。对于提取溶剂量的选择，试验中分别采用95%乙醇25、50、100、200 mL进行提取，分别测定单位质量延胡索乙素和黄芩苷峰面积。结果表明，95%乙醇100 mL提取延胡索乙素和黄芩苷均为最优，能将有效成分提取完全。为更好地除去乳膏中的基质，试验比较了硅藻土柱和聚酰胺柱的处理效果。结果表明，2种方法均对所测成分有吸附，故不采用该法，而选用95%乙醇冷浸12 h的处理方法。

3.3 耐用性试验

试验中，选用乙腈-0.1%磷酸溶液（20∶80）、乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）、乙腈-0.1%磷酸溶液（24∶76）3种流动相进行比较。图谱显示，选用乙腈-0.1%磷酸溶液（20∶80）的图谱，图中峰型较宽；选用乙腈-0.1%磷酸溶液（24∶76）的图谱，两峰间距较窄；而选用乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）的图谱，分离效果最好。最终选定乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）流动相系统，使延胡索乙素和黄芩苷达到基线分离。

[1]韩建伟，张 莉.HPLC法测定复方元胡止痛贴膏中延胡索乙素含量[J].中国药师，2009，12（5）：621.

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：附录31.

[3]张 莲.HPLC法测定妇女痛经丸中延胡索乙素的含量[J].海峡药学，2009，21（3）：63.

[4]张良晓.高效液相色谱在药物分析中的应用研究进展[J].内蒙古石油化工，2005，7：3.