高效液相色谱法检测泰乐菌素残留

泰乐菌素(Tylosin)是由美国学者Hamill于1959年自弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)合成并研制得到的十六环大环内酯抗生素，为畜禽专用抗生素，应用广泛[1，2]。泰乐菌素药渣是发酵液预处理进行固液分离时形成的菌饼部分，其中可被动物利用的营养成分很多[3]，但动物食用残留抗生素的药渣以后，不仅会破坏动物体内原有的微生态平衡、产生耐药菌，还可通过环境和食物链的作用对人体健康造成危害。基于以上原因，本课题组筛选出泰乐菌素降解菌处理泰乐菌素药渣，以使其可代替大豆、玉米等原料生产酵母培养物和饲用酶制剂。我国农业部于2001年发布《饲料药物添加剂使用规范》中规定每吨饲料的泰乐菌素添加量(均以有效成分计)是:猪10～100 g，鸡4～50 g，连用5～7 d，休药5 d。

作者在此运用高效液相色谱法检测利用泰乐菌素药渣生产的酵母培养物和饲用酶制剂中泰乐菌素含量，为开发利用抗生素药渣提供依据。

1 实验

1.1 主要试剂和仪器

泰乐菌素标准品，Sigma公司；甲醇、正己烷、磷酸、十二水磷酸氢二钠，均为分析纯；乙腈、甲醇，色谱纯。

LC-8A型高效液相色谱仪、SPD-20A型可变波长紫外-可见检测器，日本岛津公司；TGL-20M型台式高速冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；FW177型中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；DZF-1型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；PHS-3B型精密酸度计，上海精密科学仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；HH.SY21-Ni型电热恒温水浴锅，北京长源实验设备厂；UV-1100型紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.2 溶液的配制

泰乐菌素标准储备液:准确称取适量泰乐菌素标准品,用甲醇配成1000 mg·L-1的标准储备液,4℃避光保存，用0.04 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液(pH=6.5)-乙腈(70∶30)稀释至适当浓度,作为标准工作液,4℃冰箱保存。

磷酸盐缓冲溶液A：准确称取13.4703 g十二水磷酸氢二钠，溶解，用水稀释至1 L，磷酸调节pH=2.4。

磷酸盐缓冲溶液B：准确称取3.6176 g十二水磷酸氢二钠，溶解，用水稀释至250 mL，磷酸调节pH=6.5。

1.3 样品溶液的配制

1.3.1 样品脱脂

样品脱脂采用索氏提取法。称取一定量粉碎后的样品，用滤纸包好放入索氏提取器中，加入适量正己烷，75℃水浴脱至无色，取出晾干，备用。

1.3.2 样品的提取

准确称取脱脂后样品1.00 g于50 mL塑料离心管中，加入甲醇10 mL，超声提取30 min， 4℃、8000 r·min-1离心10 min，移出上清液，残渣再提取2次，合并3次提取液， 4℃、4500 r·min-1离心5 min，上清液移入100 mL圆底烧瓶中，35℃旋转蒸发至有少量残渣,用5 mL 0.04 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液(pH=6.5)-乙腈(70∶30)溶解，过0.45 μm滤膜，供高效液相色谱检测。

1.4 高效液相色谱条件

检测波长:285 nm;色谱柱：Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm);流动相：A液∶乙腈;B液：0.04 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液(pH=6.5)[4]，A液∶B液=34∶66(体积比);过0.45 μm滤膜;等度洗脱;流速：1 mL·min-1;进样量：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

用0.04 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液(pH=6.5)-乙腈(70∶30,体积比)的溶液，将泰乐菌素标准储备液分别稀释成10 mg·L-1、15 mg·L-1、20 mg·L-1的溶液，在270～295 nm范围内[5～7]，每隔5 nm测一次吸光度，结果见图1。

图1 不同波长下不同浓度泰乐菌素的吸光度值

由图1可知，泰乐菌素在波长285 nm处有最大吸光度，因此本实验选择泰乐菌素的检测波长为285 nm。

2.2 样品的前处理

经测试，抗生素药渣偏酸性，尝试了以乙腈、甲醇为提取剂，乙腈效果最好，甲醇次之，从经济角度出发，选择甲醇为提取剂。

用药渣生产的酵母培养物和饲用酶制剂的油脂含量高，由于甲醇和正己烷部分互溶，因此选择索氏提取法，先用正己烷脱脂，再用甲醇提取。

2.3 方法的线性范围、检出限

方法的最小检测限(以信噪比S/N=3计)为0.31 mg·L-1，定量限(以信噪比S/N=10计)为0.58 mg·L-1。在0.75～50 mg·L-1范围内,其标准曲线方程为y=24195x-4782.4,相关系数R2=0.9993，表明峰面积与质量浓度呈良好的线性关系。

2.4 回收率及精密度

称取一定量的干麸皮，添加10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-13个水平，每个样品重复测试5次，结果见表1。

表1 泰乐菌素平均加标回收率和相对标准偏差(n=5)

由表1可知,平均回收率为47.25%～75.92%,相对标准偏差为2.45%～8.53%(n=5)。

2.5 样品的高效液相色谱图及检测结果

饲用酶制剂原料由泰乐菌素药渣、麸皮等组成,在其中接入泰乐菌素降解菌和黑曲霉，经一定时间发酵处理后，得饲用酶制剂。酵母培养物原料由泰乐菌素药渣、玉米淀粉等组成，在其中接入泰乐菌素降解菌和酵母菌，经一定时间发酵处理后，得酵母培养物。

按照1.3方法处理，测定了实验室生产的酵母培养物和饲用酶制剂的泰乐菌素含量，结果见表2；其高效液相色谱图见图2。

表2 酵母培养物和饲用酶制剂的泰乐菌素残留检测结果

图2饲用酶制剂原料(a)、饲用酶制剂(b)、酵母培养物原料(c)、酵母培养物(d)、泰乐菌素标准品(e)的高效液相色谱图

Fig.2HPLCchromatogramsoffeedenzymestuff(a),feedenzyme(b),yeastculturestuff(c),yeastculture(d),tylosinstandard(e)

由图2可以看出，发酵前后泰乐菌素与其它化合物的分离度均很好，该方法适用于实验室生产的酵母培养物和饲用酶制剂中泰乐菌素残留的检测。

3 结论

建立了酵母培养物和饲用酶制剂中残留泰乐菌素的高效液相色谱检测方法。泰乐菌素的检出限为0.31 mg·L-1,在0.75～50 mg·L-1范围内线性相关系数R2=0.9993。在10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1添加水平的回收率为47.25%～75.92%,相对标准偏差为2.45%～8.53%。本实验为检测用药渣制得的饲用酶制剂及酵母培养物的泰乐菌素残留提出了新方法，该方法简便、高效、具有一定的参考价值，为抗生素药渣的进一步综合治理和开发利用提供了依据。

参考文献：

[1] 王海洲.泰乐菌素在养殖业中的应用[J].畜牧业,2002,(6): 18.

[2] 赵东峰,任翔,朱丽.泰乐菌素及其衍生物研究进展[J].医药产业资讯,2006,3(15):46-48.

[3] 李雪红,张煌涛，占秀梅.动物性食品中大环内酯类抗生素残留分析综述[J].草食家畜,2006,(3):10-12.

[4] Prats C,Francesch R,Arboix M,et al.Determination of tylosin residues in different animal tissues by high performance liquid chromatography[J].Journal of Chromatography B,2002，766(1):57-65.

[5] 孔科,袁宗辉,范盛先,等.高效液相色谱法检测泰乐菌素在肉鸡组织中的残留[J].中国兽医学报,1999,19(5): 489-491.

[6] 王海涛,张睿,段宏安,等.高效液相色谱法同步检测牛奶中替米考星、泰乐菌素和螺旋霉素残留量[J].分析试验室,2008,27(7): 98-101.

[7] 何绮霞，叶瑞英.HPLC法测定复方制剂中的酒石酸泰乐菌素[J].中国兽药杂志，2002,36(6): 29-30.