替加氟与牛血清白蛋白相互作用的研究

替加氟(Tegafur，TGF)是一种能阻止肿瘤细胞嘧啶类核苷酸形成的抗代谢药物，为抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶的衍生物，通过在体内活化为氟尿嘧啶而起作用，是目前临床广泛使用并对多种肿瘤具有较好疗效的抗肿瘤药物[1]，其结构见图 1。

图1 替加氟的结构式

牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)是血浆中最丰富的载体蛋白,由582 个氨基酸残基组成,可以与许多内源性或外源性的化合物结合起到存储与转运作用，是生物体内重要的药物小分子结合蛋白[2]。又由于血清白蛋白具有易于分离和提纯的特性，因而常被作为模型物质研究生物大分子与药物小分子之间的相互作用。药物与血清白蛋白相互作用效应及其结合模式的研究，能从分子水平上获取药物在生命体系演变过程中结构和能量转化的信息，在药物代谢动力学、最佳用药量、用药周期和联合用药配比的确定等方面，也具有一定的理论和应用价值[3,4]。作者利用荧光光谱法、圆二色谱法和三维荧光光谱法研究替加氟与牛血清白蛋白的相互作用，获得其相互作用机理、结合常数、结合力类型等，并考察了替加氟与牛血清白蛋白结合后BSA构象的变化。

1 实验

1.1 主要试剂及仪器

替加氟(溶液浓度1.0 ×10-3mol·L-1)，中国药品生物制品检定所；BSA(溶液浓度2.0×10-6mol·L-1)，Sigma公司；NaCl溶液(0.5 mol·L-1)；Tris-HCl缓冲溶液(pH值7.40)；所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水，经检测均无荧光杂质。

LS-55型荧光分光光度计(配备有光路长为0.1 cm的比色杯)，美国PE公司；J-810型圆二色谱仪，日本Jasco公司；AY-120M型电子分析天平，日本岛津公司；SYC-15型超级恒温水浴(控温精度±0.1℃)，南京桑力电子设备厂。

1.2 光谱测定

1.2.1 荧光猝灭光谱

荧光猝灭光谱测定条件：激发波长λex为285 nm、激发狭缝宽度为15 nm、发射狭缝宽度为5.0 nm。用微量进样器加入不同浓度的替加氟溶液，测定其与牛血清白蛋白相互作用的荧光猝灭图谱，记录波长在300～450 nm范围内的荧光光谱。

1.2.2 三维荧光光谱

三维荧光光谱测定条件：初始激发波长为200 nm，每隔5 nm记录一次200～500 nm之间的发射光谱，扫描31次，其它参数与荧光猝灭光谱相同。

1.2.3 圆二色谱

圆二色谱(CD光谱)测定条件：比色杯光路长为0.1 cm，扫描速度为200 nm·min-1。在pH值为7.40持续氮流的条件下测定190～270 nm波长范围内BSA与TGF作用前后的圆二色谱图，通过Jasco′s Spectra Manager MT软件来控制。在相同实验条件下，作为参照物的缓冲溶液从样品光谱中扣除。实验数据用MRE(摩尔椭圆率)表示。

2 结果与讨论

2.1 荧光猝灭机制和猝灭常数

荧光猝灭过程分为动态猝灭和静态猝灭，可从温度影响、粘度影响或荧光寿命等方面加以区分。本实验根据温度对猝灭常数的影响来确定猝灭机制。研究表明，对于静态猝灭过程，其猝灭常数随温度的升高而减小，相反，动态猝灭常数随温度的升高而增大[5]。因此可以根据不同温度下BSA与TGF作用时，BSA猝灭常数的变化来区分猝灭类型。pH值等于7.40时，不同浓度的TGF与BSA作用的荧光发射光谱见图2。

T=298 K；λex=285 nm；c(BSA) =2.0×10-6 mol·L-1;c(TGF)(×10-6 mol·L-1),A～I:0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0

由图2可知，当激发波长为285 nm时，BSA在350 nm波长处有一个强的荧光发射峰。随着TGF的不断加入，BSA的荧光强度逐渐降低，表明TGF是一种有效的荧光猝灭剂，它与BSA发生了缔合作用。

为了判断上述体系的猝灭机制，用经典Stern-Volmer方程[6]分析4个不同温度下(292 K、298 K、304 K、310 K)的荧光猝灭数据：

F0/F=1+KSVcQ=1+Kqτ0cQ

(1)

式中：F0和F分别表示不存在和存在猝灭剂时生物大分子的荧光强度；KSV为Stern-Volmer 猝灭常数；cQ为猝灭剂的浓度;Kq为生物大分子的猝灭速率常数；τ0为不存在猝灭剂时生物大分子的平均寿命。以F0/F对cQ作图(如图3所示)，应用方程(1)计算4个温度下的猝灭常数KSV，结果见表1。

图3 4个不同温度下pH=7.40时的Stern-Volmer关系图

表1 4个不同温度下TGF与 BSA 相互作用的Stern-Volmer猝灭常数

由表1可知，猝灭常数KSV随温度的升高而降低，298 K时的Kq值远大于生物大分子的最大分散碰撞猝灭常数(2.0×1010L·mol-1·s-1)[7]，初步判断实验中的荧光猝灭是由复合物的生成引起的，为静态猝灭。

对于静态猝灭，猝灭数据由修正的Stern-Volmer方程[6]作进一步的分析：

F0/(F0-F)=1/(faKacQ)+1/fa

(2)

式中:fa是荧光基团可接近猝灭剂的部分(分数)；Ka为有效猝灭常数，它近似于TGF-BSA作用体系的结合常数。F0/(F0-F)与cQ的倒数值呈线性关系(如图4所示)。

图4 4个不同温度下pH=7.40时修正的Stern-Volmer曲线

表2 修正的Stern-Volmer方程的相关结合常数与TGF-BSA 体系的相关热力学参数

比较表1和表2可知，Ka随温度的变化趋势与KSV一致，说明TGF与BSA的结合过程确实为生成复合物的静态猝灭过程。

2.2 替加氟与BSA的结合模式

一般说来，小分子与生物大分子间的作用力主要包括疏水作用力、氢键、Vander Waals力、静电引力等[8]。假如焓变(ΔH)在所研究的温度范围内变化不大，其值可近似为常数，于是熵变(ΔS)由Van′t Hoff方程确定：

1nK=-ΔHθ/RT+ΔSθ/R

(3)

式中：K为相应温度下的结合常数；R为摩尔气体常数。lnK和1/T之间存在很好的线性关系，如图5所示，焓变(ΔH)和熵变(ΔS)可以分别从方程(3)的斜率和截距中得出。自由能变(ΔG)由下式计算：

ΔGθ=ΔHθ-TΔSθ

(4)

计算结果列于表2。

图5 BSA与TGF相互作用的范特霍夫曲线

Ross等[9]从大量蛋白质和药物反应的实验中总结出了热力学参数值与作用力间的联系：ΔH>0、ΔS>0为疏水作用力；ΔH<0、ΔS<0为氢键和范德华力；ΔH<0、ΔS>0为静电引力。同时结合其它文献[10]的观点，由焓变(-55.00 kJ·mol-1)和熵变(-105.17 J·mol-1·K-1)的值，可知结合过程的主要作用力为氢键和范德华力。

2.3 替加氟对BSA构象的影响

2.3.1 圆二色谱

为了研究TGF对BSA构象的影响，测定了室温条件下BSA和TGF-BSA体系的圆二色谱(CD光谱)，如图6所示。BSA的α-螺旋结构的定量分析结果也列于图6。

c(BSA)=2.0×10-6 mol·L-1；c(TGF)(×10-5 mol·L-1),A～C:0,1.0,2.0

由图6可知，BSA的α-螺旋结构在208 nm和222 nm的紫外区出现两个负的特征肩峰谱带 。游离态的BSA中，α-螺旋结构的含量为62.83%，但当BSA 与TGF的浓度比达到1∶10时，这个数值降至56.92% 。表明α-螺旋结构有所伸展，TGF与蛋白质多肽主链的氨基酸残基结合，并且破坏了蛋白质的氢键结构。很明显，TGF的加入导致BSA两个负的肩峰带强度明显减小，但是峰的形状和峰高位置没有发生改变。因此，推断TGF的存在对BSA二级结构有一定的影响，而α-螺旋结构依然占主导地位[11]。

2.3.2 三维荧光光谱

三维荧光光谱不仅可以全面展现待测样品的荧光信息，而且可以使蛋白质特征构象变化的研究更具科学性和可靠性。它也是另外一种证实BSA构象和微环境是否改变的有效方法。TGF-BSA 体系的三维荧光光谱及数据分析分别见图7和表3。

c(BSA)=2.000×10-6 mol·L-1;c(TGF)(×10-6 mol·L-1),A:0,B:2.000

表3 BSA和 TGF-BSA复合物的三维荧光光谱特征

由图7可知，峰a是瑞利散射峰(λex=λem)[12]，它的强度因TGF的加入而增大，原因可能是由于TGF-BSA复合物的生成使得溶液中溶质的直径增大，散射效应增强。峰b是二级散射峰(λem=2λex) 。峰1(λex=280.0 nm,λem=351.0 nm)显示了色氨酸和酪氨酸残基的光谱行为，是研究荧光猝灭时的主荧光峰。此外，还有一个新的强荧光峰2(λex=225.0 nm,λem=351.5 nm)，根据此前的研究结果推测峰2主要显示多肽主链结构的荧光性质，并且该峰的荧光强度与蛋白质的二级结构密切相关[13]，当在蛋白质溶液中加入TGF后，该峰的荧光强度发生了一定程度的猝灭，说明BSA的二级结构发生了变化。结合表3数据及对比图7A和图7B可知，加入TGF后峰1和峰2的强度分别猝灭了27.82%和17.18% 。结合CD光谱的结果，得出以下结论：TGF与BSA的相互作用导致部分蛋白质肽链发生解旋使蛋白质多肽链更加舒展，构象发生改变。

3 结论

在模拟生理条件下，测定不同温度下TGF对BSA的荧光猝灭图谱，判断出该反应为形成复合物的静态猝灭过程。并由Van′t Hoff方程求得了不同温度下的热力学参数。由焓变(-55.00 kJ·mol-1)和熵变(-105.17 J·mol-1·K-1)为负值，推断出维持复合物稳定的主要作用力为范德华力和氢键。计算得到的吉布斯自由能小于零，说明TGF与BSA之间发生了缔合作用，且该反应能自发进行。圆二色谱和三维荧光光谱分析发现，在加入TGF之后，BSA中α-螺旋结构的含量减少，部分蛋白质肽链发生解旋，BSA的构象和所处的微环境发生了一定程度的改变。

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