一种喹唑啉酮衍生物与牛血清白蛋白的相互作用

喹唑啉酮类化合物是一类具有药效的小分子，在医药领域具有重要的研究价值。喹唑啉酮类化合物具有多种生理活性，主要表现在对表皮生长因子受体(EGFR)或酪氨酸激酶(EGFR.TK)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血小板衍生生长因子(PDGFR)、神经生长因子受体(NGFR)及其它多个作用靶点的抑制活性，从而发挥抗癌、抗菌、抗病毒等多种药理作用，引起了人们广泛的研究兴趣。3-(2-羟乙基)-2-对甲苯胺基喹唑啉-4(3-H)-酮(HTQ)作为喹唑啉酮类化合物的一种衍生物可以预见有很好的生物活性[1]，其结构如图1所示。

图1 HTQ的结构式

蛋白质是生物体内最重要的一类生物大分子，药物进入人体后需要通过血浆的储运才能发生药理作用，血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白。通过测定血清白蛋白的变化，可为疾病诊断、疗效观察提供有价值的资料及数据。因此，从不同角度研究以白蛋白为代表的蛋白质与具有生物活性的小分子间的相互作用，从而了解药物的作用机制，已成研究热点。

活性小分子与血清白蛋白相互作用的研究是介于化学与生命科学之间的边缘性课题，采用的研究方法有荧光法、紫外光谱法和色谱法等，其中荧光法研究药物活性小分子与蛋白质的结合反应不仅灵敏度高，而且可以综合利用蛋白质和活性小分子的荧光猝灭、能量转移和实验条件的影响等方面的信息，因而是主要的研究手段[2]。作者在此应用荧光光谱法和紫外吸收光谱法研究了HTQ与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，包括结合位置、结合常数、作用力类型、共存物质的影响以及药物在血液中的分配等。

1 实验

1.1 试剂与仪器

HTQ由咸宁学院化学与生命科学学院有机合成实验室提供；BSA溶解在Tris-HCl缓冲溶液中，实验前15 min配制BSA溶液；Tris(生化试剂)；浓盐酸；NaCl；所用试剂均为分析纯；实验用水为二次亚沸水。

带恒温槽系统的F-4500型荧光分光光度计、UV-2300型可见分光光度计，日本日立公司；BS-120型电子分析天平(d=0.0001)；PHS-3C型数字式酸度计。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

蛋白质溶液的配制：分别称取0.0355 g BSA溶于Tris-HCl缓冲溶液中,配制50 mL不同温度(T=298 K、302 K、306 K、310 K)下pH值7.4的1×10-5mol·L-1BSA溶液。

猝灭剂的配制：称取0.0012 g HTQ溶于2 mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，配制成浓度为2×10-3mol·L-1的HTQ溶液。

在2 cm比色皿中分别加入2 mL 1×10-5mol·L-1的BSA溶液和不同量的2×10-3mol·L-1HTQ溶液，得不同摩尔比的BSA-HTQ系列溶液。

1.2.2 紫外吸收光谱分析

测定摩尔比为1∶1的BSA-HTQ溶液的紫外吸收光谱。

1.2.3 荧光光谱分析

测定各溶液在不同温度下的荧光光谱。激发和发射狭缝均为2.5 nm,以λex=295 nm激发,在300～500 nm波长范围内扫描并绘制不同浓度HTQ溶液对BSA的荧光猝灭光谱。分别固定Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm扫描其同步荧光光谱。

2 结果与讨论

2.1 HTQ对BSA的荧光猝灭

HTQ作为荧光猝灭剂，在与BSA结合的过程中，能不同程度地猝灭BSA的荧光强度。固定BSA浓度为1×10-5mol·L-1，向其中分次(每次2 μL，共7次)加入2×10-3mol·L-1的HTQ溶液，测定各次BSA的荧光光谱，结果见图2。

a～h.HTQ用量(μL)：0,2,4,6,8,10,12,14

由图2可以看出，随着HTQ浓度的增大，BSA的荧光强度有规律地降低。由于HTQ分子本身在λ=367 nm附近没有荧光峰，故HTQ不会发生与BSA相互干扰的荧光，因此，HTQ对BSA的荧光有猝灭作用。

2.2 猝灭机理的推断

荧光被猝灭的原因有三种：动态猝灭、静态猝灭和非辐射能量转移。荧光猝灭过程通常可以分为动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子发生作用导致荧光猝灭的过程,其过程遵循Stern-Volmer方程[3]：

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式中：F0、F分别为不存在和存在猝灭剂时荧光物质的荧光强度；KSV为Stern-Volmer动态猝灭常数；Kq为双分子猝灭过程速率常数；τ0为猝灭剂不存在时荧光分子平均寿命(生物大分子荧光寿命约为1×10-8s )[4]；[Q]为猝灭剂(HTQ)浓度，mol·μL-1。通常各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数为2.0×1010L·mol-1·s-1(Kq≤2.0×1010L·mol-1·s-1)[5]。

静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子的基态分子发生作用导致荧光猝灭的过程，静态猝灭可用Lineweaver-Burk双倒数函数关系来描述:

(2)

式中：KLB为基态配合物的生成常数。

一般情况下，动态和静态猝灭可依据不同温度条件下的结果得以区别。对于动态猝灭，温度的升高将增加分子间的有效碰撞和加剧能量转移过程，导致动态荧光猝灭常数KSV增大。对于静态猝灭，温度的升高将降低药物与蛋白所形成复合物的稳定性，导致猝灭常数减小[6]。

分别研究了在298 K、302 K、306 K、310 K时，加入HTQ后BSA荧光强度的变化，并绘制BSA的Stern-Volmer曲线，结果见图3。

图3 不同温度下(F0/F)-1～[Q]关系

由图3可知，随着温度的升高，KSV增大。

由线性方程求得猝灭常数KSV和相关系数，根据KSV=Kqτ0计算得到4个温度下的猝灭速率常数Kq均小于2.0×1010L·mol-1·s-1。表明HTQ对BSA的猝灭是由于分子间碰撞而引起的动态猝灭。

表1 HTQ对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer方程 以及相关的KSV

2.3 作用力类型的分析

活性小分子和生物大分子之间的相互作用力包括氢键力、静电引力、范德华力、疏水作用力等。不同分子与蛋白质的结合力类型是不同的。Ross等根据大量的实验结果，总结出判断生物大分子与有机小分子等结合力性质与结合作用热力学函数之间关系的规律，根据反应前后热力学焓变ΔH和熵变ΔS的相对大小，可以判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型：ΔH>0、ΔS>0为疏水作用力；ΔH<0、ΔS<0为氢键力和范德华力；ΔH≈0、ΔS>0为静电引力[7]。假设在测定温度范围内焓变变化不大，则它的值和熵变ΔS可以从Van′t Hoff 方程求得:

lnK=-ΔH/(RT)+ΔS/R

(3)

这里的K值近似于相应温度下Stern-Volmer方程中的猝灭常数KSV,通过lnKSV对1/T作图(图4),直接算出ΔHθ和ΔSθ，再由ΔGθ=ΔHθ-TΔSθ可计算出ΔGθ，相关数据列于表2。

pH=7.4,c(BSA)=1×10-5 mol·L-1

表2 Stern-Volmer 动态猝灭常数KSV及相关热力学参数(pH=7.4)

由表2可知,该反应是自发的(ΔG<0)，HTQ对BSA的作用力主要为疏水作用力(ΔH>0、ΔS>0)。

2.4 HTQ与BSA的结合位点数和结合常数

对于动态猝灭过程,荧光强度与猝灭剂的关系可由荧光分子和猝灭剂分子之间的结合常数表达式推导求出[8]。设BSA有n个独立的结合位点,则其与HTQ间的猝灭反应可表示为BSA+n[Q]=BSA[Q]n，其表观结合常数Kb=[BSA[Q]n]/[BSA][Q]n。若荧光体总浓度为[BSA]0,则[BSA]0=[BSA[Q]n]+[BSA],当[Q]≫[BSA]0时,猝灭剂的起始浓度代替其平衡浓度,则Kb=([BSA]0-[BSA])/[BSA][Q]n。

动态猝灭中,体系的荧光强度F与其游离荧光体浓度成正比,将[BSA]/[BSA]0=F/F0代入上式得：

lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[Q]

(4)

式中：n为结合位点数；Kb为表观结合常数。绘制lg[(F0/F) - 1]～lg[Q]直线，斜率就是结合位点数n、截距就是lgKb。相关数据列于表3。

由表3可知，在接近人的生理温度(310 K)时，结合位点n接近1，说明HTQ与BSA易以1∶1形成复合物，且温度对HTQ与BSA的结合常数Kb影响较小(Kb值均在2.228×10-2～3.356×10-2L·mol-1之间),Kb平均值为2.846×10-2L·mol-1。说明HTQ与BSA之间有较强的结合作用，可以被蛋白质所储存和运输。

表3 不同温度下的表观结合常数Kb和结合位点数n

2.5 HTQ与BSA的能量转移机制以及结合距离

能量转移作用可以发生在药物蛋白质复合物内部,也可以发生在药物与蛋白质分子之间。在后一种情况时，利用Förster能量转移理论,可以求出和蛋白质作用的药物与色氨酸残基之间的距离,由此推测药物与蛋白质结合的空间部位。

按Förster的偶极-偶极非辐射能量转移理论[9]，可求得化合物HTQ结合时结合位置与蛋白质分子中荧光发射基团之间的距离:

(5)

式中：E为能量转移效率；r为给体(BSA)和受体(HTQ)的距离；R0为转移效率为50%时的临界距离，可由下式求出:

(6)

式中:K2为偶极空间取向因子;n为介质的折射指数;Ф为给体的荧光量子产率;J为给体的荧光发射光谱与受体吸收光谱的光谱重叠积分，即：

(7)

式中:F(λ)为荧光给体在波长λ处的荧光强度;ε(λ)为受体在波长λ处的摩尔吸光系数。

图5为BSA与HTQ的摩尔比为1∶1时，HTQ的吸收光谱与BSA荧光发射光谱的重叠图。

图5 BSA的荧光发射光谱(a)和HTQ的吸收光谱(b)

将图5的光谱重叠部分按式(7)求出J。在上述实验条件下，取K2=2/3、n=1.36、Ф=0.15，代入式(6)可求出R0=2.69 nm；通过式(5)求出能量转移效率E=0.84。根据R0、E的值，由式(5)算出BSA内色氨酸残基与HTQ的距离r=2.04 nm,符合能量转移理论,说明BSA与HTQ是足够靠近(r<8 nm),其结合是通过非辐射能量转移而促使蛋白质的荧光猝灭。

2.6 HTQ对BSA构象的影响

同步荧光光谱已经被应用于蛋白质构象的分析。由Δλ=15 nm所得的同步荧光只显示蛋白质中酪氨酸残基的荧光，由Δλ=60 nm所得的同步荧光只显示蛋白质中色氨酸残基的荧光，因残基的最大发射波长与其所处环境的极性有关，故由发射波长的改变可以判断蛋白质构象的变化[10]。

固定BSA的浓度，逐渐增大(每次2 μL)HTQ的浓度，记录Δλ=15 nm和Δλ=60 nm时的同步荧光光谱，结果见图6。

pH=7.4;c(BSA)=1×10-5 mol·L-1;c(HTQ)=2×10-3 mol·L-1，a～i(μL)：0,2,4,6,8,10,12,14,16

图6中的最大峰为蛋白质的荧光峰，可见色氨酸残基的最大发射波长基本不变，酪氨酸残基的最大发射波长红移(图6两直线所示)。表明HTQ的加入使BSA的构象发生了变化,酪氨酸残基所处环境的疏水性降低,BSA内部的疏水结构有所瓦解。

BSA及BSA-HTQ体系的三维荧光光谱见图7、强度等高线图见图8。

c(BSA)=1×10-5 mol·L-1;c(HTQ)=2×10-3 mol·L-1;T=310 K

c(BSA)=1×10-5 mol·L-1;c(HTQ)=2×10-3 mol·L-1

比较BSA及BSA-HTQ的三维荧光光谱特征,从峰的类别看:图7中的两条逐渐升高的“山脊”形峰分别对应于图8中的两条“铅笔”形纹线，它们的共同特征是λex=λem(Δλ=0)，是瑞利散射线；图7中λem=295 nm左右的两个“驼峰”形宽峰分别对应于图8中瑞利散射线右下方的“指纹”线,λem基本保持不变，这都是荧光峰的典型特征。从峰的位置看:加入HTQ后，BSA的瑞利散射峰起始位置及荧光峰位置均无明显变化。从峰的强度看:加入HTQ后,瑞利散射峰的强度和荧光峰的相对强度均有不同程度的降低。BSA的空间结构由3个结构域组成，每个结构域由2个亚结构域以槽口相对的方式形成圆筒状结构，几乎所有的疏水性氨基酸残基都包埋在圆筒内部，构成疏水腔，HTQ分子的结合部位可能都处于这种疏水腔中，正是HTQ分子的加入导致了这种疏水微环境极性的改变，进而导致了BSA构象的变化[11]。

3 结论

应用荧光光谱法、紫外吸收光谱法研究了HTQ与BSA 的相互作用。结果表明，HTQ对BSA的荧光猝灭机理是动态猝灭过程,表观结合常数Kb为2.846×10-2L·mol-1、结合位点数接近于1，HTQ与BSA以摩尔比1∶1结合,其结合反应主要是熵驱动,反应中主要作用力是疏水作用力。BSA内色氨酸残基与化合物HTQ分子间的距离r=2.04 nm，加入HTQ后BSA的构象发生了变化。

参考文献：

[1] 曹胜利,冯玉萍,张玫,等.4(3H)-喹唑啉酮芳胺衍生物的合成及其抗肿瘤活性评价[J].应用化学,2007,24(2):162-167.

[2] 孙绍发,於敏敢,朱先军.光谱法研究一种含咪唑啉酮类衍生物与牛血清白蛋白的相互作用[J].华中师范大学学报(自然科学版),2007,41(3):406-410.

[3] Liu J Q,Tian J N,Hew Y,et al.Spectrofluorimetric study of the binding of daphnetin to bovine serum albumin[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2004,35(4):671-675.

[4] Sun S F,Pan L L,Wang C M,et al.Interaction of an organic selenium compound with human serum albumin.A spectroscopic study[J].Biological Trace Element Research,2006,114(1-3):301-311.

[5] 胡艳军,刘义,侯安新,等.稀土杂多酸盐EuHSiMo10W2O40·25H2O与BSA相互作用的研究[J].化学学报,2004,62(16):1519-1523.

[6] 吴秋华,王春,王志，等.应用荧光猝灭法研究尼莫地平与牛血清白蛋白的相互作用[J].光谱学与光谱分析,2007,27(11):2317-2320.

[7] 吴刚珂,颜承农,刘义.头孢呋辛酯与牛血清白蛋白相互作用特征研究[J].光谱学与光谱分析,2008,28(9):2139-2143.

[8] Sun S F,Xiang G Y,Hou H N,et al.Studies on interaction between 4-(4-hydroxybut-2-ynyloxy)-3-(phenylsulfonyl)-1,2,5-oxadiazole-2-oxide and bovine serum albumin by spectroscopic method[J].Chinese Journal of Chemistry,2006,24(8):1050-1053.

[9] Ross P D,Subramamian S.Thermodynamics of protein association reactions:Forces contributing to stability[J].Biochemistry,1981,20(11):3096-3102.

[10] 贾文志,孙绍发.光谱法研究一种喹唑啉酮衍生物与牛血清白蛋白的相互作用[J].化学世界,2009,50(1):4-8.

[11] 张华新,颜承农,童金强,等.三维荧光光谱法研究桑色素与蛋白质的耦合反应[J].化学与生物工程,2005,22(4):26-29.