高效液相色谱法测定维生素C注射剂的含量

赵 敏 胡付华

邵阳市第一人民医院药剂科，湖南 邵阳 422000

维生素C又名抗坏血酸，参与氨基酸代谢、神经递质的合成、胶原蛋白和组织细胞间质的合成，可降低毛细血管的通透性，加速血液的凝固，刺激凝血功能，促进铁在肠内吸收，促使血脂下降，增加对感染的抵抗力，参与解毒功能，且有抗组胺的作用及阻止致癌物质(亚硝胺)生成的作用，其临床用途广泛。维生素C还具有重要的生化作用，在医药、日用化工、食品、生物等领域有重要的应用价值。维生素C是烯醇化合物，在水中极易氧化，见光加速分解。维生素C注射液pH值为5.5～7.0，具有极强的还原性，在碱性溶液中易氧化失效，氧化剂、光、热及金属离子能加速其失效[1]。因此，温度过高或过低均可加快维生素C的分解，抗氧化剂、温度25℃、pH为5.6～6.0时维生素C注射液最为稳定[2]。

维生素C注射剂含量的测定方法很多，各种方法各有其特点，《中国药典》2005年版二部采用碘量法测含量[3]，此法虽然操作简单，但因制剂中常有还原性物质存在，对此法干扰明显，且由于碘具有挥发性，碘离子易被空气所氧化而使滴定产生误差。常见的其他滴定法存在滴定终点难以准确判断，分光光度法操作费时，而高效液相色谱法是目前发展较为迅速的一种方法，灵敏度高，选择性好，本试验的目的在于寻找一个准确高效的测定维生素C含量的方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器：美国Waters 公司的高效液相色谱仪（包括600泵、2996可变波长紫外检测器），奥立龙868型pH酸碱计上海热电仪器有限公司。

1.2 试剂：维生素C对照品：中国药品生物制品检定所，批号：2139C，规格：100mg/瓶；维生素C注射液：山东新华制药股份有限公司，批号：0807122，规格：5mL(1.0g)/支；5%葡萄糖注射液：上海百特医疗用品有限公司，批号：GS0809048，规格：250mL/袋；焦亚硫酸钠（Na2S2O5）：分析纯，上海试四赫维化工有限公司，批号：060512，含量比重≥96.0%；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件：色谱柱：Xterra RP C18(150mm×4.6mm，5μm)，以0.01mol·L-1（pH为3.5）的磷酸二氢钠水溶液为流动相，柱温为25℃，系统流速为0.6mL·min-1，检测波长为265nm。色谱图见图1。

2.2 标准曲线的制备：准确称取维生素C对照品10.0mg，0.02mol·L-1焦亚硫酸钠溶液溶解并定容到25mL的容量瓶中[2]，摇匀，得贮备液，并予避光保存。

准确量取维生素C贮备液6mL和纯水4mL，得对照品A液；取A液5mL和1mL纯水，得对照品B液；取B液4mL和1mL纯水，得对照品C液；取A液2mL和2mL纯水，得对照品D液；取B液1mL和1mL纯水，得对照品E液，从而得5个高中低不同浓度的对照品溶液。取20μL进样测定。按“2.1”项下色谱条件进样，测定对照品的峰面积，以浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，求得维生素C的回归方程为：

图1 维生素C高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of vitamin C

维生素C：Y=8.95×103X+7.36×105(r=0.9992，n=5)；

结果，维生素C在50～120μg·mL-1浓度范围内呈良好的线性关系。

2.3 精密度试验：按“2.1”项下色谱条件，取“2.2”项下对照品溶液，低（维生素C浓度为60μg·mL-1）、中（维生素C浓度为80μg·mL-1）、高（维生素C浓度为100μg·mL-1）系列浓度分别重复进样3次，于第1d、3d、5d分别考察其日内及日间精密度，测定峰面积。结果维生素C的日内RSD%为0.87%，其日间RSD%为1.03%。

2.4 回收率试验：分别取低（维生素C浓度为80μg·mL-1）、中（维生素C浓度为100μg·mL-1）、高（维生素C浓度为120μg·mL-1）系列浓度的对照品溶液0.5mL（每个浓度取3份），分别准确加入维生素含量为100μg.mL-1的样品溶液0.5mL中，摇匀，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果，维生素C的加样回收率为100.36%。

2.5 稳定性试验：将“2.2”项下100μg·mL-1维生素C溶液20μL，分别以0、1、2、4、6、8h进样，记录色谱图，峰面积RSD为0.68%，结果表明，供试品溶液在8h内稳定。

2.6 重复性试验：取批号为0807122的样品，按含量测定方法配制6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，其RSD为0.33%。

2.7 样品测定：按“2.1”项下色谱条件，进样3个不同批次的样品含量，结果以标示量计，3批样品批示量含量分别为：100.67%、98.37%、101.01%，均在95%～110%之间。

3 讨论

根据维生素C的理化性质和特点，本实验考察了不同流动相的组成及不同浓度，不同PH值及温度等对分离效果的影响。结果确定柱温为25℃，以0.01mol·L-1（pH为3.5）磷酸二氢钠为为流动相，流速为0.6mL·min-1。但因维生素C极易氧化，故笔者选取0.02mol·L-1的焦亚硫酸钠水溶液稀释配备维生素C对照品溶液维持其稳定性。另外，维生素C对光不稳定，在储存中应注意避光。

该方法具有灵敏，准确，高效的特点，适合维生素C注射液的检测。

[1]陈新谦，金有豫，汤光.新编药物学[M].人民卫生出版社，2003.(15)：630.

[2]郝志耘.维生素C稳定性实验研究[J].牡丹江医学学报，1997，18（1）：13-4.

[3]国家药典委员会编.《中国药典》[S].北京：化学工业出版社，2005.