电针对拟老年性痴呆大鼠学习记忆和海马神经元突触形态可塑性的影响研究

王 威 唐 伟 孙忠人

1)大连大学附属中山医院康复医学科 大连 116001 2)大连大学附属新华医院神经内科 大连 116001 3)黑龙江中医药大学 哈尔滨 150040

本研究通过建立一个集衰老、铝中毒以及胆碱能系统损害等多因素的AD动物模型,研究针刺对AD大鼠学习记忆、海马神经元突触形态可塑性的影响,以进一步探讨针刺改善AD大鼠学习记忆功能的中枢机制,为针刺治疗AD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1动物健康雄性Wistar大鼠50只,由大连医科大学动物实验中心提供(许可证号为辽实动质字[2000]028号)。自由进食,每日照明12 h,室温(23±2)°C。

1.2药品及主要试剂JEM-1220型透射电子显微镜;LKB-V超薄切片机;跳台仪(大连大学附属新华医院提供);图像分析系统(Image Pro Plus 6.0,美国)。

1.3方法

1.3.1 动物分组及处理:按照体质量将50只大鼠随机分成4组:空白对照组(10只)、空白电针组(10只)、模型组(15只)和模型电针组(15只)。全部实验动物用相同的饲料喂养,整个喂养过程中所使用的器皿均为非铝制品。空白对照组:予常规饮水和饲料,并胃饲及腹腔注射与模型组等容量的生理盐水;空白电针组:在给予生理盐水同时进行电针治疗;模型组:SCOP+AlCl3+D-gal;模型电针组:在造模同时进行电针治疗。

1.3.2 穴位选择:百会:顶骨正中;大椎:第七颈椎棘突与第一胸椎间,背部正中;肾俞:第二腰椎下两旁;足三里(后三里):膝关节后外侧,腓骨小头下约5 mm处。

1.3.3 针刺方法:用0.25 mm×15 mm毫针针刺大鼠“百会”穴,向前斜刺约 3 mm,“大椎”穴,直刺约 4 mm,双侧“肾俞”穴,直刺进针 5 mm,双侧“足三里”穴,直刺进针 5 mm。连接KWD-808Ⅱ型全能脉冲电疗仪,疏波,频率2 Hz,电压2 V,强度以肢体轻微抖动为度。1次/d,时间20 min。10 d一疗程,间歇1 d,治疗三个疗程后进行行为学测试。

1.3.4 大鼠行为学检测:跳台实验[1]:电针治疗结束后进行跳台实验;实验装置为15 cm×30 cm×30 cm的被动条件反射箱,箱底铺以铜栅,铜丝直径2 mm,间距5 mm;电流强度由一个可调变压器控制,通以36 V电流,箱内右后侧放置一个高和直径均为4.5 cm的橡皮垫作为大鼠逃避电击的安全区。将大鼠放入箱中自由活动3 min,熟悉环境,然后箱底通以电流,其正常反应是跳上平台以躲避伤害性刺激;记录大鼠首次跳到铜栅上的时间(即潜伏期)和5 min内大鼠跳到铜栅上的次数(错误次数),以此作为学习成绩。24 h后重复试验,记录其第一次跳下橡皮垫的潜伏期和5 min内的错误次数,从而反映大鼠的记忆保持能力。

测试结束后,每组随机取5只动物,经3%戊巴比妥钠麻醉后,常规心脏灌注后断头剥脑,按照大鼠脑立体定位解剖图谱取海马区固定、丙酮梯度脱水、浸透、包埋、切片(厚600A0),230目铜网捞片、3%柠檬酸铅+0.1%醋酸铀双重电子染色后电镜下观察结果。电镜观察首先遵循确认突触的标准固确认突触:(1)可见突触的前后膜;(2)可见致密带;(3)突触前膨大内可见3个以上突触小泡。然后电镜下大体观察,按体视学禁线法则,进行突触形态学参数突触数密度(Nv)、面密度(Sv)和平均面积(S)的体视学测量。

1.4统计学分析由第一作者完成。数据用±s表示,采用SPSS 13.0进行统计分析。各组间的跳台实验潜伏期、错误次数、超微结构各参数采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计学处理。

2 结果

2.1实验动物数量分析纳入动物50只,48只大鼠进入结果分析,模型组和模型电针组各有1只动物因胃饲误入气管致死。

2.2跳台实验(潜伏期、错误次数)结果表 1显示,与空白对照组比较,模型组大鼠出现明显的学习记忆功能障碍,潜伏期缩短,错误次数增加(P＜0.01)。与模型组比较,电针治疗能够改善大鼠的学习和记忆功能,延长潜伏期和减少错误次数(P＜0.05,P＜0.01)。

表1 各组跳台实验(潜伏期和错误次数)比较 (±s)

表1 各组跳台实验(潜伏期和错误次数)比较 (±s)

与空白组比较,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.05,3)P＜0.01

组别 n 学习记忆潜伏期/s 错误次数/次 潜伏期/s 错误次数/次空白组 10 30.79±4.02 4.12±1.49 234.60±36.52 0.91±0.56空白电针组 10 32.68±5.67 4.44±1.42 226.11±37.74 0.67±0.51模型组 14 25.60±3.131) 6.32±1.411) 159.30±23.421) 2.51±1.081)模型电针组 14 31.10±4.882) 4.22±1.312) 191.24±33.743) 1.45±0.963)

2.3海马CA1区突触电镜结果空白组、空白电针组神经毡内可见大量突触,突触前后成分境界清楚,轮廓完整,突触前终末内突触小泡多,分布密集均匀,多为圆形清亮小泡(图1A和1B)。模型组神经毡内突触数目减少,突触前膜不清晰,突触间隙模糊,前、后膜不明显,突触小泡明显减少甚或消失,突触前、后膜破坏变薄,典型的突触结构已不存在(图1C)。模型电针组神经毡内可见较多突触,突触前终末内突触小泡也较多,可见较多圆形清亮小泡,密集分布,突触前、后膜较模型组增厚,与空白组接近(图1D)。表2结果表明,与空白组比较,模型组大鼠海马CA1区突触面数密度、面积密度和体积密度匀减小(P＜0.05和P＜0.01);模型电针组大鼠海马CA1区突触面数密度、面积密度和体积密度匀有所增大(P＜0.05),提示电针能有效抑制突触减少。

表2 各组大鼠海马 CA1区超微结构各参数比较±s)

表2 各组大鼠海马 CA1区超微结构各参数比较±s)

与空白组比较,1)P＜0.05,2)P＜0.01;与模型组比较,3)P＜0.05,4)P＜0.01

电 镜组别 n 面数密度(个/μ m2)面积密度(μ m2/μ m3)体积密度空白组 5 6.89±1.53 0.66±0.15 0.066±0.016空白电针组 5 6.43±1.42 0.68±0.18 0.063±0.017模型组 5 4.54±1.531) 0.46±0.141)0.041±0.0122)模型电针组 5 6.16±1.323) 0.60±0.143) 0.056±0.0153)

图1 海马CA1区突触超微结构

3 讨论

老年痴呆是老年期发生的以认知与智能障碍为主要特点的疾患,中医又称为“老年呆病”,其病位在心、脑。早在《黄帝内经》中就有“心者,君主之官,神明出焉”、“心者,五脏六腑之大主,精神之所舍也”等观点。中医防治老年性痴呆症主要是从整体的角度去分析这一病证的内在实质,针对某一病证个体做出客观的判断,实施针对性很强的防治措施。本研究所选百会穴为髓海的上输穴,治疗髓海不足健忘、老年性痴呆的要穴;大椎穴是手足六阳经的交会穴,为“诸阳之会”;百会穴和大椎穴均为督脉之穴,二穴相配可通调诸经,激发经气,增强各脏腑经络之功效,使脑髓得气血荣养,促使阴阳平衡。肾俞为膀胱经穴位,可益肾填髓充脑,《灵枢·经脉》言“膀胱足太阳之脉,起于目内眦,上额交巅。其直者,从巅入络脑”。足三里为强壮保健的要穴,有延缓衰老的作用。如此配穴体现了配穴原则中的局部与远道取穴的结合运用。数穴合用,临床上取得较好疗效。

有研究表明,D-半乳糖致亚急性衰老模型、慢性铝中毒和东莨菪碱中毒都能模拟老年痴呆样改变[2-4],三种因素复合的模型能更贴近AD复杂的病因和病理变化过程,在这种模型上研究针刺作用效果所得出的结论可能更加可靠。从本研究建立的集衰老、铝中毒与东莨菪碱损害的多因素AD大鼠模型行为学观察表明,大鼠跳台测试的触电潜伏期及5 min错误次数与对照组比较均有明显改变。与空白对照组比较,模型组潜伏期缩短,错误次数增多,说明本研究建立的集衰老、铝中毒与东莨菪碱损害的多因素的AD大鼠模型是成功的;电针治疗后潜伏期延长,错误次数减少表明针刺能明显保护和改善多因素损害所造成的大鼠记忆障碍。本研究的结果提示,针刺可改善AD模型动物的学习和记忆能力。

有研究表明,针刺具有拮抗衰老过程中的病理生理变化[5]。电镜下观察到电针组海马区神经毡内可见较多突触,突触前终末内突触小泡也较多,可见较多圆形清亮小泡密集分布。针刺改善AD大鼠学习记忆能力的机制,可能是针刺刺激增加了大鼠由于造模而损伤坏死的边缘区的记忆突触,即胆碱能突触,使其密度增加,从而使残存的神经元发挥更大的作用,使记忆突触间隙变窄,得以加速突触间的传导功能;同时脑内存在一些神经传导的旁路,针刺刺激可引起神经冲动,经外周神经传导至中枢神经系统,经平时少起作用的旁路刺激大脑皮质,从而引起坏死边缘区突触数目和结构的改变;突触后膜致密物质厚度增加,可能与某些酶及其底物蛋白的磷酸化过程引起其分子构型改变有关,这可能是功能变化的形态学基础。针刺作为一种对机体无损伤性治疗手段,将会在临床防治AD和其他衰老疾病方面发挥重要作用,本研究为临床进一步推广提供了必要的实验依据。

[1]徐淑云.药理实验方法学[M].第2版.北京:人民卫生出版社,1994:660.

[2]李文彬,韦丰,范明,等.D-半乳糖在小鼠上诱导的拟脑老化效应[J].中国药理学与毒理学杂志,1995,9(2):93.

[3]朱清华,熊希凯,章锡平,等.铝对大鼠学习记忆神经递质脑结构形态的损害[J].同济医科大学学报,1992,2l(增):8-10.

[4]李斌,郭德玉,李林.三种老年痴呆动物模型行为学比较[J].中国实验动物学报,1999,(7):1.

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