子宫内膜癌与胰岛素-Ras-MAPK信号通路的相关性研究*

田文艳 窦文婷 王颖梅 张丽志 薛凤霞 张 灏

子宫内膜癌是妇科三大恶性肿瘤之一，近年来发病率呈上升趋势。子宫内膜癌的发生与多种因素有关，胰岛素抵抗与高胰岛素状态可能与子宫内膜癌的发生有关。胰岛素存在2条信号通路：磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K－Akt）通路及Ras－丝裂原活化蛋白激酶（Ras-MAPK）通路。笔者前期的研究发现PI3K-Akt通路在子宫内膜癌发生发展中起重要作用[1-2]。本研究观察胰岛素-Ras-MAPK信号中的关键分子生长因子受体结合蛋白2（growth factor receptor binding protein 2，Grb-2）、Ras、磷酸化-胞外信号调节激酶（P-ERK）、细胞周期素D1（CD-1）在正常子宫内膜、非典型增生子宫内膜、子宫内膜癌组织中的表达，分析其表达与血清胰岛素的相关性，探讨胰岛素-Ras-MAPK信号传导通路在子宫内膜癌发生、发展中的作用，为子宫内膜癌的靶向治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取自2004年1月—2007年12月于我院妇产科住院治疗患者的石蜡标本。所有患者术前均未接受放疗、化疗或激素治疗。子宫内膜癌（EC）组：51例，年龄32～78岁，平均（56.8±10.1）岁，其中子宫内膜样腺癌46例，非子宫内膜样腺癌5例（包括透明细胞癌1例，浆液性乳头状腺癌4例）。根据2009年国际妇产科联盟FIGO标准进行病理组织学分级和手术病理分期。手术病理分期：Ⅰ期38例，Ⅱ期4例，Ⅲ期7例，Ⅳ期2例。其中，无浸润5例，子宫肌层浸润深度≤1/2者29例，>1/2者17例。病理组织学分级：Ⅰ级（高分化，G1）25例，Ⅱ级（中分化，G2）17例，Ⅲ级（低分化，G3）9例。子宫内膜非典型性增生（AHE）组：10例，患者年龄32～63岁，平均（48.3±10.2）岁。正常子宫内膜（NE）组：48例，年龄39～80岁，平均（51.4±10.3）岁，其中分泌期20例，增生期28例，正常子宫内膜组织取材于因良性疾患行子宫全切术的患者。所有标本均经经病理复查核实。3组间年龄比较差异无统计学意义（F=0.055，P＞0.05）。

1.2 研究方法

1.2.1 血胰岛素水平测定 放免法测定子宫内膜癌患者血清胰岛素水平（mU/L）。

1.2.2 免疫组织化学法检测Grb-2、Ras、P-ERK、CD-1在子宫内膜组织中的表达 所有标本经10%甲醛液固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，用免疫组织化学二步法进行染色。一抗鼠抗人Ras单克隆抗体，一抗鼠抗人Grb－2单克隆抗体，一抗鼠抗人CD－1单克隆抗体购于美国Santa Cruz生物有限公司。一抗鼠抗人P－ERK单克隆抗体、PV-9000通用型试剂盒DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。磷酸盐缓冲液代替抗体作阴性对照，细胞核用苏木素复染。已知阳性的乳腺癌组织切片作为阳性对照。高倍镜下随机抽取5个不同的视野，各计数200个细胞，以每高倍视野下阳性细胞数量及染色强度判断。评价标准：根据阳性细胞染色深浅及阳性细胞比例打分，细胞无色为0，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；无阳性细胞0分，阳性细胞数<10%为1分，阳性细胞数10%～50%为2分，阳性细胞数>50%以上为3分。累计积分0～2分为阴性（－），3～4分为阳性（＋），5～6分为强阳性（＋＋）。

1.3 统计学方法 应用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，各组资料比较采用卡方（χ2）检验，不同指标相关性运用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果Grb-2阳性物质均定位于细胞核和（或）细胞浆中，见图1。Ras阳性物质定位于细胞浆中，见图2。P-ERK的阳性物质定位于细胞核和（或）细胞浆中，见图3。CD-1阳性物质定位于细胞核中，见图4。

2.2 Grb-2、Ras、P-ERK及CD-1在子宫内膜组织中的表达情况Grb-2、P-ERK和CD－1在3组间阳性表达率差异有统计学意义（P＜0．05或P＜0．01）；Ras在3组间阳性表达率差异无统计学意义（P＞0．05），见表1。

表1 3组患者子宫内膜组织中Grb-2、Ras、P-ERK和CD-1的阳性表达情况 （例）

2.3 Grb-2、Ras、P-ERK和CD-1表达与血清胰岛素以及各指标的相关性Grb-2、P-ERK表达与血胰岛素水平呈正相关（P＜0．05）。Ras、CD－1表达与血胰岛素水平无相关性（P＞0．05）。Grb－2与Ras、P－ERK表达呈正相关，差异有统计学意义（P＜0．05），与CD－1无明显相关性（P＞0．05），见表2。

表2 Grb-2、Ras、P-ERK和CD-1与血清胰岛素以及各指标的相关性 （r）

2.4 不同子宫内膜癌患者Grb-2、Ras、P-ERK和CD-1表达情况 见表3。肿瘤的不同病理分期Grb-2和P－ERK的阳性表达差别有统计学意义（P＜0．01），Ⅱ～Ⅳ期阳性率高于Ⅰ期。在有无淋巴结转移的子宫内膜癌中Grb－2阳性表达比较差别有统计学意义（P＜0．05）。其余各指标与其他临床病理因素差别无统计学意义（P＞0．05）。

3 讨论

胰岛素除调节物质代谢外，还可作为生长因子家族中的一员，调控细胞的增殖与凋亡。胰岛素在肿瘤生长调控中存在2条信号传导机制：PI3K-Akt及Ras-MAPK通路。本课题组前期研究证实子宫内膜癌细胞及组织存在胰岛素受体（IR）表达与活化，通过其下游的PI3K-Akt通路参与肿瘤细胞增殖与凋亡[1-2]。但Ras-MAPK途径研究较少，尤其是在肿瘤组织中的研究，胰岛素与IR结合后，激活的IR可直接使Shc的酪氨酸残基磷酸化，Shc再与Grb－2结合，经GDP－GTP交换因子激活Ras，进而激活Raf－1激酶、MAPK的激酶（MAPKK，也称MEK），MAPKK磷酸化后激活MAPK。MAPKs家族包括3个亚族：ERKs、JNKs和p38MAPKs。活化的MAPK可使许多靶蛋白磷酸化，引起多种癌基因及细胞周期调控蛋白CyclinD1等相继激活，促进细胞分裂[3]。

Grb-2是生长因子-Ras信号传导途径中的一个关键接头分子，是Ras上游通路的重要组成部分。Yu[4-5]等研究发现大肠癌转移灶较原发灶癌组织高表达基因有190条，其中转移灶高表达的基因中Grb-2的差异最为明显，达70倍，Grb-2与肿瘤的生长、浸润、远处转移密切相关。本研究显示，子宫内膜癌Grb-2阳性表达率升高，表明子宫内膜癌存在胰岛素受体信号传导通路下传的基础，Grb-2的高表达与子宫内膜癌的发生有关系。在不同病理分期及有无淋巴结转移的子宫内膜癌中Grb-2的阳性表达比较差异有统计学意义，提示Grb-2参与子宫内膜癌的生长、浸润及转移。

表3 子宫内膜癌组织中Grb-2、Ras、P-ERK和CD-1阳性表达与临床病理学特征的关系 （例）

Ras癌基因为原癌基因,Ras癌基因的激活是肿瘤发生的早期事件。本研究中Ras过度表达与各临床病理因素无关，与本课题组成员于1997年的报道相同[6]。ERKs为MAPK家族重要成员。Mueller等[7]研究显示P-ERK在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织，P-ERK高表达与淋巴结转移、复发有关。本实验显示：P-ERK在子宫内膜癌组织中呈现过表达，且不同病理分期间比较，差异有统计学意义，提示P-ERK可能参与子宫内膜癌的发展过程。目前认为，CD-1可驱动细胞由G0期进入S期，促进细胞增殖。而当CD-l表达失控时，则将引起细胞增殖周期失调，从而导致肿瘤发生。Choudhury等[8]研究显示子宫内膜癌CD-1表达阳性率明显高于单纯性增生子宫内膜，与本试验结果相同。

子宫内膜癌三大高危因素肥胖、糖尿病、高血压，多囊卵巢综合征（PCOS）患者是年轻子宫内膜癌的高危人群。而这些疾病共同的病理生理基础为胰岛素抵抗和高胰岛素血症，提示胰岛素与子宫内膜癌的发生有关。本研究中血胰岛素水平与Grb-2、PERK呈正相关。Grb-2可直接或间接地与生长因子受体或其相连接的蛋白质发生相互作用。叶韵斌等[10]研究表明P-ERK的活化需要Grb-2的参与。本研究中子宫内膜癌Grb-2与Ras、P-ERK蛋白表达呈正相关，说明Grb-2、Ras、P-ERK的过表达在子宫内膜癌中具有一致性，进一步证明胰岛素-Ras-MAPK通路在子宫内膜癌的发生发展中具有重要作用。理论上MAPK活化后，进一步诱导CyclinD1的表达和活化，但本研究中Grb-2、Ras、PERK均与CD-1蛋白表达无相关性，推测CD-1过表达除受胰岛素-Ras-MAPK通路的调节外，还受其他因子的调节。

本研究揭示了胰岛素信号传导通路在参与子宫内膜癌发生、进展中的重要作用，为子宫内膜癌靶向治疗提供了理论依据。但胰岛素-Ras-MAPK信号通路还包括哪些重要的信号因子、在子宫内膜癌中与PI3K-Akt信号通路的协同作用均有待于进一步的研究。

[1]赵敬,薛凤霞,华绍芳,等.胰岛素对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响[J].中华妇产科杂志,2007,42(10):696-700.

[2]华绍芳,薛凤霞,赵敬.磷脂酰肌醇3激酶通路在胰岛素调节子宫内膜癌细胞增殖凋亡中的作用[J].中国实用妇科与产科杂志,2007,23(11):843-845.

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[5]Yu GZ,Chen Y,Wang JJ.Overexpression of Grb-2-HER2 signaling in Chinese gastric cancer:their relationship with clinicopathological parameters and prognostic significance[J].J Cancer Res Clin Oncol,2009,135(10):1331-9.

[6]薛凤霞,焦书竹，王海燕,等.子宫内膜癌ras及HER-2/neu癌基因的表达[J].中华妇产科杂志,1997,32（2）：110.

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[9]叶韵斌,陈慧菁.抑制生长因子受体连接蛋白22表达对乳癌细胞生长的影响[J].中国药理学与毒理学杂志,2008,22(1):55-62.