流行性乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

赵付荣,华荣虹,王 斌,陈娜莎,阿合买提·买买提,步志高

(1.新疆农业大学动物医学院,新疆 乌鲁木齐 830052;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部兽医公共卫生重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150001)

流行性乙型脑炎(JE)简称乙脑,是由乙型脑炎病毒引起的一种重要蚊媒性人兽共患传染病。多种动物易感,蚊是JEV的主要传播媒介,猪是其主要的储存宿主和扩散宿主。乙脑对猪的危害主要为:妊娠母猪发生流产和死胎,公猪发生睾丸炎,育肥猪持续高热,新生仔猪脑炎。该病主要流行于东亚和南亚各国,而我国是乙脑发病人数最多的国家,占世界总发病数的80%以上[1]。近年来,乙脑的流行分布范围呈扩大的趋势,乙脑的诊断和防治研究具有重要的公共卫生学意义。

JEV属于黄病毒科黄病毒属,基因组为正链单股RNA病毒,基因组长度11 kb。病毒粒子有3个结构蛋白:核衣壳蛋白(C)、膜蛋白(PrM/M)、囊膜糖蛋白(E)。E蛋白基因大小为1500 bp,由其编码的E蛋白是病毒粒子表面最重要的结构蛋白,其表面的抗原决定簇,具有血凝活性和中和活性。E蛋白与病毒的毒力、宿主范围、组织嗜性、膜融合、保护性免疫、血凝反应和血清特异性有关[2-4]。本研究成功制备1株抗JEV E蛋白的单克隆抗体,并对其部分性质进行了鉴定,为今后探索新的JE临床诊断方法及E蛋白结构与功能提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种、实验动物及试剂 含E基因的原核表达质粒 pET32a-E,大肠杆菌 BL21(DE3)、BHK-21细胞、SP2/0细胞,表位融合蛋白GST-E1、GST-E10、GST-E11、GST-E19、GST-E33、GSTE39、GST-E45、GST-E48、GST-E49 及 GST 纯化蛋白均由兽医生物技术国家重点实验室制备或保存。实验用SPF级BALB/c小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2 重组JEV E蛋白的表达与纯化 将表达菌种接种于含100 mg/L氨苄青霉素的 LB培养基中,37℃培养过夜后,按1∶100接种于新鲜LB培养基中,继续培养至对数生长期,加IPTG诱导,培养物离心后用1/20体积 PBS重悬,超声波裂解后12000 r/min离心,分离上清和沉淀,12%SDSPAGE检测表达情况。表达蛋白包涵体按文献[7]方法进行分离纯化。

1.3 小鼠免疫 以纯化的 JEV E蛋白对8周龄SPF级BALB/c小鼠按如下程序免疫:首次免疫用纯化的E蛋白和弗氏完全佐剂等量混合,充分乳化,于小鼠颈背部分多点皮下注射;间隔2周用弗氏不完全佐剂乳化抗原加强免疫2次,取脾细胞融合前3天用纯化抗原经尾静脉加强免疫1次。

1.4 细胞融合、杂交瘤细胞的筛选及纯化 细胞融合过程按文献报道的方法[6]进行。以纯化的E蛋白作为包被抗原,用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆株。将经初步筛选得到的可疑阳性细胞克隆株用有限稀释法再进行3～5次单克隆,同时用间接ELISA方法进行检测,直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%时,即可确定已获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单克隆经扩大培养冻存于液氮中。

1.5 单克隆抗体腹水的制备 取成年的BALB/c小鼠,于腹腔内预先注入0.5mL的弗氏不完全佐剂,1周后,再将筛选到的阳性杂交瘤细胞分别以3×105个/0.5mL细胞的剂量注入小鼠的腹腔,约7 d左右,当小鼠的腹腔增大时,抽取腹水,5000 r/min离心取上清,-20℃冻存备用。

1.6 单抗效价的测定及亚类鉴定 切胶纯化E蛋白为抗原,用间接ELISA法测定培养杂交瘤细胞上清和小鼠腹水单克隆抗体效价。亚类的鉴定试剂盒说明书方法操作。

1.7 Western blot鉴定 参考文献[7]进行。以单克隆杂交瘤细胞培养上清作为一抗,以SP2/0细胞上清做阴性对照,以红外荧光标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗,用红外荧光扫描仪进行扫描。

1.8 单克隆抗体的特异性鉴定 分别以纯化的表位融合蛋白 GST-E1、GST-E10、GST-E11、GSTE19、GST-E33、GST-E39、GST-E45、GST-E48、GST-E49与GST为抗原分别包被ELISA板,用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清液与表位融合蛋白的反应性,以纯化的GST蛋白作为阴性对照。

2 结果

2.1 重组蛋白的表达与纯化 重组质粒经测序检验正确后,转化至感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达和分离纯化后进行SDS-PAGE分析,可见大小约70 ku的目的蛋白的表达,与预期结果一致(图1),且纯化后的蛋白可被猪阳性血清识别(图1)。

图1 E蛋白表达的表达与纯化

2.2 杂交瘤细胞株的建立 经过融合、间接ELISA检测和4次亚克隆,共筛选到1株稳定分泌抗JEV E蛋白的杂交瘤细胞,将其命名为5D4。该杂交瘤细胞经液氮冻存复苏后,生长状态良好,分泌抗体能力正常。

2.3 McAb效价以及Ig亚类鉴定 杂交瘤细胞培养上清液做2倍系列稀释,腹水先100倍稀释,再做2倍系列稀释,以纯化E蛋白为包被抗原进行间接ELISA检测。结果表明,细胞培养上清液的抗体效价为1∶1024,腹水抗体效价为1∶409600。经鉴定,该单抗亚型为IgG2a,轻链为κ链。

2.4 单抗的免疫活性分析 将JEV SA14-14-2株接种BHK-21细胞作为抗原,进行SDS-PAGE。通过半干电转仪转印至NC膜,以单克隆杂交瘤细胞培养上清作为一抗,以SP2/0细胞上清做阴性对照,以FITC标记的羊抗鼠红外荧光作为二抗,然后在红外荧光扫描仪进行扫描。结果可见15株单抗均能特异性地识别表达的重组蛋白及JEV SA14-14-2株感染细胞中的E蛋白,在53 ku处有一明显特异反应条带,而阴性对照 SP2/0培养上清不与JEV E蛋白发生反应(图2)。

图2 Western blot检测单克隆抗体免疫活性

2.5 单克隆抗体的特异性试验 分别以纯化的融合蛋 白 GST-E1、GST-E10、GST-E11、GST-E19、GST-E33 、GST-E39 、GST-E45 、GST-E48 、GST-E49和纯化的GST蛋白为包被抗原,采用间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清。结果显示,单抗5D4能与GST-E10反应,而与GST不反应。表明该单抗是针对表位E10的。

3 讨论

对乙型脑炎尚无特效治疗方法,早期诊断仍是有效控制该病的重要手段,各种针对病毒结构蛋白的免疫学诊断技术以其特异性强、成本较低、易操作等特点成为实践中检测病原的常用方法。免疫学诊断的特异性和准确性直接取决于诊断试剂,目前应用于诊断的抗体制剂多是由全病毒抗原免疫动物制备的多克隆抗血清,其复杂的抗体成分和由不同动物个体和不同批次制备免疫血清造成的抗体效价的差异,使检测的稳定性、特异性受到限制。单克隆抗体纯度高、专一性强、重复性好且能在动物体外或体内产生同质性抗体,以它作为诊断抗体能克服多克隆抗血清诊断时稳定性差及非特异性强等缺点。

本试验在制备JEV E蛋白单抗的过程中,将纯化的E蛋白免疫BALB/c小鼠,提高了抗 E蛋白McAb的阳性率,用淋巴细胞杂交瘤技术建立了1株分泌抗E单克隆抗体的杂交瘤细胞系,筛选时用纯化的E抗原包被反应板采用间接ELISA方法进行检测,这种高纯度的包被抗原使得筛选方法简便、高效。获得的1株能稳定分泌抗E的单克隆的杂交瘤细胞株,Western blot结果也表明此株抗JEVE蛋白McAb特异性强,表位鉴定表明此株单克隆抗体是针对表位E10的,有研究表明表位E10处于E蛋白的免疫优势决定区[8]。从一定意义上说,表位疫苗是缩微的亚单位疫苗。基于多表位的疫苗含有广谱的表位信息,可以避免因病毒变异而造成的疫苗免疫失败。但在各分离株中高度保守的表位序列(特别是中和表位),在疫苗的研制中具有重要的参考价值。所以本研究结果为下一步探索新的JE诊断方式奠定了基础,同时也为研究E蛋白的免疫保护机制提供了物质条件。

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