孕妇外周血中游离胎儿DNA在出生缺陷产前诊断中的研究

王 健，赵富玺

（1.山西医科大学免疫教研室，山西太原 030001；2.山西大同大学医学院微生物与免疫教研室，山西大同 037009）

出生缺陷已成为一个严重的社会问题，通过孕妇外周血中游离胎儿DNA对出生缺陷进行产前诊断是当今的研究热点．随着相关技术和实验方法的不断提高，孕妇外周血中游离胎儿DNA逐步成为出生缺陷疾病产前诊断可靠且敏感的指标．现将十年来关于游离胎儿DNA在出生缺陷中的研究情况做一综述．

1 出生缺陷的现况及其产前诊断的技术发展

1.1 出生缺陷的概述及现状

出生缺陷是指婴儿出生时就存在各种身体结构、智力或代谢方面的异常．是导致新生儿死亡和儿童残疾的重要原因．大部分的出生缺陷是由遗传和环境因素所致．出生缺陷主要包括两大类型，一种是先天结构畸形，如神经管缺陷，在出生时就可以发现，凭临床观察即可确诊;另一种是功能、代谢、行为异常，如先天性智力残障，要到出生后几个月或几年发病才能被诊断，且需要特殊的检测手段才能检查出来．

全世界每年大约有500万缺陷婴儿出生，每年至少有330万5岁以下儿童死于出生缺陷，320万存活儿童终身残疾．我国《国家人口发展战略研究报告》指出：我国每年约有80万至120万缺陷儿出生，占全部出生人口的4%到6%，其中肉眼可见的先天畸形儿有20万到30万；卫生部统计数据表明，全国每年因新生儿缺陷所造成的直接损失达8亿元，用于抚养残疾儿童的医疗费用支出高达150亿元．另外，这些残疾人给家庭造成的心理和精神负担更是无法估量的．

1.2 出生缺陷产前诊断的技术发展

产前诊断作为出生缺陷的二级预防，对降低缺陷儿出生率起着重要的作用．目前，产前诊断技术项目包括医学影像、生化免疫、细胞遗传和分子遗传等方面．B超、MRI等影像检查在孕中期胎儿结构异常的诊断中发挥着重要的作用，然而对功能、代谢等方面出生缺陷的诊断也存在敏感性低且假阳性率高的弊端．生化检查的指标往往需多项联合检测，但检出率低．胎儿细胞可以作为胎儿遗传信息的可靠来源，传统的获取胎儿细胞进行产前诊断的方法如羊膜腔穿刺术、绒毛膜取样等均具有创伤性，有的甚至造成感染、流产．有研究者[1]从孕妇的外周血中提取到胎儿有核红细胞作为研究的靶细胞，但是孕妇外周血中胎儿有核红细胞的数量很少，检测技术相当繁琐．1997年，Lo[2]等发现在孕妇外周血中存在着游离胎儿DNA，这为非侵入性产前诊断提供了新的途径．

2 孕妇外周血中游离胎儿D N A作为出生缺陷产前诊断重要指标的理论依据

2.1 孕妇外周血中游离胎儿DNA的基本特征

2．1．1 来源

游离胎儿DNA的来源可能是多方面的，来自胎儿细胞的凋亡，胎儿组织或胎盘的释放，有研究者[3]从5个假妊娠妇女的血浆中检测到胎儿Y染色体特异序列DYS 14，且浓度与正常早期孕妇相当．证实了游离胎儿DNA主要来源于滋养层细胞．

2.1.2 动力学性质

有研究表明[4-5]，早在妊娠后32 d就可以检测到母外周血游离胎儿DNA，在第8周检测准确率达100%．而且胎儿DNA的量随着妊娠进程不断的增加，产后数小时内消失，这说明了母血中胎儿游离DNA较母血中胎儿细胞在产前诊断中更具优势．

2．1．3 生物学特性

①Chan[6]等发现妊娠妇女血浆中胎源性DNA分子较母源性DNA分子长度短很多，可以利用琼脂糖凝胶电泳分离后进行回收，从而达到粗略分离母胎DNA的目的．②Angert[7]等发现抽血后在 EDTA抗凝管中放置24 h时游离胎儿DNA都是稳定的．近来，Zhang[8]等发现在采血后放置36 h的样品中加甲醛处理可使胎儿DNA的检出率由4．6%增加到13．1%．另外，离心之后的游离胎儿DNA在血浆中更能长期保持稳定，Koide等[9]证实母血浆中游离胎儿 DNA在－20℃贮藏至少可以保存4年．Bischoff等[10]报道了采用母血干纸片检测胎儿DNA，大大方便了标本的采集和运送．这都为胎儿DNA作为一个可靠的临床诊断指标奠定了基础．

2.2 相关模型的建立

目前对孕妇血中游离胎儿DNA的分析主要是以人为研究对象，鉴于伦理道德的约束，许多试验设计无法开展．近来，Jimenez等[11]发现在怀孕的母恒河猴血清中也能检测到游离胎儿DNA，母猴血清中游离胎儿DNA的含量随着妊娠期的延长而增加，分娩后母猴血内游离胎儿DNA的清除非常迅速，许多研究数据均与人类相似，表明恒河猴可以作为研究母血浆和血清中游离胎儿DNA的一个良好动物模型．另有研究者发现[12]，游离胎儿DNA在妊娠鼠的外周血中也有类似的特点，为今后的深入研究提供了依据．

2.3 生物学标记物的发展

最初，是通过Y染色体特异的序列SRY、DYS 14、DYZ 3等区分母胎DNA，然而这些序列的诊断仅适用于50%的怀男性胎儿的孕妇．后有大量的研究集中在短串联重复序列（STRs）和单核苷酸多态性（SNPs）上．如Vodicka[13]对21号染色体的3个STR位点进行了精确定量．Dhallan等[14]建立了通过单核苷酸多态性（SNPs）区分胎儿DNA和孕母DNA并诊断胎儿染色体数目的方法．

随着表观遗传学的发展，应用DNA甲基化进行无创性产前诊断开始变为可能．Chim等[15]研究证实，maspin基因在胎盘细胞中处于低甲基化状态，而在母血细胞中处于高甲基化状态，孕妇血浆中低甲基化的maspin序列在分娩后迅速被清除，同时发现母血浆中低甲基化的maspin序列中存在胎儿SNP基因型．表明低甲基化的maspin可以作为不受胎儿性别和遗传多态性影响的通用标记．2006年Chan等[16]发现了位于3号染色体的RASSF1A基因在母血细胞和胎盘间有着不同的甲基化形式，应用甲基化敏感的限制性内切酶消化法更容易实现检测．Old等研究[17]表明胎儿AIRE基因可以作为无创性产前诊断唐氏综合征的一个重要候选表观遗传标记．

2.4 相关检测技术的进步

2．4．1 PCR 技术的发展

虽然孕妇血中胎儿游离DNA较胎儿细胞含量丰富，但其绝对量仍然极少，需要非常敏感的方法才能获得稳定可靠的检测结果．近年报道的用于产前基因诊断的PCR技术包括：①巢式PCR法，针对待检基因设计内外两种引物，进行了两次扩增，使PCR反应的敏感性和特异性都得到提高．②多重PCR法，在一个反应中应用两对及两对以上引物同时扩增多个序列的PCR技术，常用于检测同个基因的多种基因型缺失．③引物延伸预扩增（PEP）－PCR法，主要以15 bp的随机寡核苷酸为引物在DNA聚合酶的作用下先行对标本中总DNA进行扩增，使原有的基因组拷贝数量放大数十倍，以供进一步 PCR分析的方法．④实时荧光定量（QF）－PCR法，是目前国内外临床实验室推荐使用的基因诊断方法，是通过荧光检测系统实时监测累计荧光强度而最终实现始点定量．⑤甲基化特异性PCR（MSP）法，是对亚硫酸氢钠处理后的模板DNA行PCR扩增，根据处理后甲基化和非甲基化序列产生的差异设计两对引物，通过PCR扩增来检测分析目的基因的甲基化状况，Chim等[15]用该法检测了孕妇血浆中表观标记maspin．

2．4．2 基因突变诊断技术的进步

①分子杂交和印渍（迹）法：以已知序列核酸片段作为探针，经放射性或非放射性物质标记后，再与未知的目的核酸片段进行杂交反应，通过标记信号的检测对分离出的未知目的核酸链进行定性、定量分析．常用方法有斑点杂交法、Southern杂交法、基因芯片法等．②PCR相关突变诊断技术：是对PCR扩增前后的目的基因片段进行特殊处理后通过电泳表现出差异，进而分析突变的方法．主要有PCR－限制性内切酶谱分析（RFLP）、单链构向多态性 PCR（SSCP）等．

2．4．3 DNA 序列分析法

是基因突变检测的最直接，最准确的方法，它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质．Christina等[18]利用鸟枪法成功地对孕早期的9例21三体，2例18三体和1例13三体胎儿DNA进行测序．

3 孕妇外周血中的游离胎儿D N A在出生缺陷产前诊断中的应用

3.1 预告妊娠相关性疾病,减少胎儿的环境危险因素

孕妇由于妊娠的生理变化及免疫功能的影响，易发生妊娠合并症，进而影响胎儿的宫内发育，造成各种出生缺陷甚至死亡，所以尽早诊断和有效防治孕妇妊娠合并症非常重要．研究表明，当发生异常妊娠时，孕妇血浆DNA及游离胎儿DNA水平会出现不同程度的升高．先兆子痫是较常见的妊娠相关性疾病，该病患者血浆胎儿DNA浓度较正常增加了5倍，这种变化不仅发生在临床表现之前，还与病情的严重程度密切相关[19]．胎儿DNA亦可作为早产的标志，早产时胎儿DNA浓度明显升高，而且保胎成功后胎儿DNA浓度会有所下降．另外胎盘感染、先兆流产[20]、前置胎盘等均有胎儿DNA浓度的异常．

3.2 诊断相关胎儿基因,预防先天性疾病

3．2．1 性连锁遗传病

性连锁遗传病种类很多，以X－连锁隐性遗传病为主，常见的有血友病、假性肥大性肌营养不良症、红绿色盲等．携带致病基因的母亲不会使女儿患病，所以没有必要对女胎孕妇行产前基因诊断．患X－连锁显性遗传病的父亲一定会使女儿致病，Y－连锁的疾病一定会遗传给儿子．所以早期的性别诊断可以使我们有目的地对患儿行相关的干预．研究[21]证实DYS14是孕早期最有效的诊断胎儿性别的指标．

3．2．2 RhD 血型不合性溶血

RhD阴性妇女在第二胎孕RhD阳性胎儿时，可发生RhD血型不合而导致新生儿溶血、核黄疸甚至死亡，因此产前确定胎儿的RhD血型对RhD阴性的孕妇很重要．Muller等[22]准确地检测了1 113例RhD阴性孕妇外周血中胎儿RhD基因型，证实了该项检测的临床可行性．

3．2．3 胎儿非整倍体病

胎儿非整倍体病是目前致胎儿出生缺陷的重要原因．其中21、18、13及性染色体数目异常占出生后染色体异常总数的95%．有研究者通过检测相对染色体剂量（RCD）的方法诊断21三体综合征，先设置一个非21染色体上的DNA序列为参照，测量游离胎儿21染色体来源的DNA序列的量，通过比较两者的量，测得相对染色体剂量（RCD），21染色体正常的胎儿RCD值为2：2，而21三体胎儿的RCD是3：2[23]．也有研究者利用 18染色体上父源性和母源性某等位基因的表观学差异，测杂合子胎儿的等位基因比率（AR），正常胎儿AR是1：1，而18三体胎儿的基因比率是2：1[24]．

3．2．4 诊断父系遗传的单基因病变

孕母外周血中的游离胎儿DNA不仅用于有效诊断父源的显性遗传病如肌强直性营养不良、软骨发育不全、HD（慢性进行性舞蹈病）[25]等，也逐步应用于父源的隐性遗传病的产前诊断，Li[26]等成功地对父源性不同类型的β－地中海贫血突变体等位基因进行了诊断．

4 面临的困难和技术挑战

孕妇外周血中游离胎儿DNA在预防出生缺陷的产前诊断中已取得了一定的成绩，然而要进一步发展仍面临着众多难题：①孕妇外周血中游离胎儿DNA只占母总DNA的3%～6%，只有在胎儿DNA的富集方面有所突破，才能有效地提高诊断的阳性率．②现阶段的研究还局限于母体中分离出来的胎儿DNA片段，所以要扩大它的应用范围，新的生物学标记物有待于进一步的发现．③孕妇外周血中的胎儿DNA在出生缺陷产前诊断的应用多局限于小样本实验，将来还需要大样本量的可行性研究，使胎儿DNA更适应于临床应用．④目前研究的只是一小部分出生缺陷类型，更多的由于环境、多基因等复杂因素引起的出生缺陷与游离胎儿DNA的关系有待深入地探索．⑤要突出胎儿DNA不同于血清学标记物的特点，不仅要从量的变化中作出预测，还应努力在基因水平上分析胎儿DNA．使其不仅可以作为预测指标，更能成为诊断、监测和评价的指标．

[1]Simpson J L,Elias S.Isolating fetal cells from maternal blood.Advances in prenatal diagnosis through molecular technology[J].JAMA,1993,270:2357-2361.

[2]Lo Y M,Corbetta N,Chamberlain P F,et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Lancet,1997,350(9076):485-487.

[3]Alberry M,Maddocks D,Jones M,et al.Free fetal DNA in maternal plasma in anembryonic pregnancies:confirmation that the origin is the trophoblast[J].Prenat Diagn,2007,27(5):415-418.

[4]Wataganara T,Chen A Y,Leshane E S,et al.Cell-free fetal DNA levels in maternal plasma after elective first trimester termination of pregnancy[J].Fertil Steril,2004,81(3):638-644.

[5]Costa J M,Benachi A,Gautier E,et al.First-trimester fetal sex determination in maternal serum using real-time PCR[J].Prenat Diagn,2001,21(12):1070-1074.

[6]Chan K C A,Zhong J,HuiABY,et al.Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma[J].Clin Chem,2004,50(1):88-92.

[7]Angert R M,LeShane E S,Lo Y M,et a1.Fetal cell-free plasma DNA concentrations in maternal blood are stable 24 hours after collection:analysis of first-and third-trimester samples[J].Clin Chem,2003,49:195-198.

[8]Zhang Y,Li Q,Hui N,et al.Effect of formaldehyde treatment on the recovery of cell-free fetal DNA from maternal plasma at different processing times[J].Clin Chim Acta,2008,397(1-2):60-64.

[9]Koide K,Sekizawa A,1wasaki M,et a1.Fragmentation of cell-free fetal DNA in plasma and urine of pregnant women[J].Prenat Diagn,2005,25:604-607.

[10]Bischoff F Z,Dang D X,Marquez-Do D,et al.Detecting fetal DNA from dried maternal blood spots:another step towardsbroad scale noninvasive prenatal genetic screening and feasible testing[J].Reprod Biomed Online,2003,6(3):349-351.

[11]Jimenez D F,Tarantal A F.Quantitative analysis of male DNA in maternal serum of gravid rhesus monkeys[J].Pediatr Res,2003,53(1):18-23.

[12]Khosrotehrani K,Wataganara T,Bianchi DW,et al.Fetal cell-free DNA circulates in the plasma of pregnant mice:relevance for animal models of fetomaternal trafficking[J].Hum Reprod,2004,19:2460-2464.

[13]Vodicka R,Vrtel R,Dusek L,et al.Refined fluorescent STR quantification of cell-free fetal DNA during pregnancy in physiological and Down syndrome fetuses[J].Prenat Diagn,2008,28(5):425-433.

[14]Dhallan R,Guo X,Emche,et al.A non-invasive test for prenatal diagnosis based on fetal DNA present in maternal blood:a preliminary study[J].Lancet,2007,369(9560):474-481.

[15]Chim S S C,Tong Y K,Chiu R W K,et al.Detection of the placental epigenetic signature of the maspin gene in maternal plasma[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:14753-14758.

[16]Chan K C,Ding C,Gerovassili A,et al.Hypermethylated RASSF1A in maternal plasma:A universal fetal DNA marker that improves the reliability of noninvasive prenatal diagnosis[J].Clin Chem,2006,52:2211-2218.

[17]Old R W,Crea F,Puszyk W,et al.Candidate epigenetic biomarkers for non-invasive prenatal diagnosis of Down syndrome[J].Reprod Biomed Online,2007,15(2):227-235.

[18]Christina F H,Blumenfeld Y J,Chitkara U,et al.From the Cover:Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood[J].Quake PNAS,2008,105:16266-16271.

[19]Sekizawa A,Farina A,Sugito Y,et a1.Proteinuria and hypertension are independent factors affecting fetal DNA values:a retrospective analysis of affected and unaffected patients[J].Clin Chem,2004,50:221-224.

[20]Yin A H,Ng E H Y,Zhang X Z,et a1.Correlation of maternal plasma total cell-free DNA and fetal DNA levels with short term outcome of first-trimester vaginal bleeding[J].Hum Reprod,2007,22:1736-1743.

[21]Picchiassi E,Coata G,Fanetti A,et a1.The best approach for early prediction of fetal gender by using free fetal DNA from maternal plasma[J].Prenat Diagn,2008,28(6):525-530.

[22]Muller S P,Bartels I,Stein W,et a1.The determination of the fetal D status from maternal plasma for decision making on Rh prophylaxis is feasible[J].Transfusion,2008,48(11):2292-2301.

[23]Lo Y M D,Lun F M F,Chan K C A,et al.From the Cover:Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104:13116-13121.

[24]Tong Y K,Ding C,Chiu R W K,et al.Noninvasive prenatal detection of fetal trisomy 18 by epigenetic allelic ratio analysis in maternal plasma:theoretical and empirical considerations[J].Clin Chem,2006,52:2194-2202.

[25]Aragones A B,Tiebas M J T,Merlo J G,et al.Prenatal diagnosis of Huntington disease in maternal plasma:direct and indirect study[J].Eur J Neurol,2008,15(12):1338-1344.

[26]Li Y,Naro E D,Vitucci A,et al.Detection of Paternally Inherited Fetal Point Mutations for β-Thalassemia Using Size-Fractionated Cell-Free DNA in Maternal Plasma[J].JAMA,2005,293:843-849.