两种尿素浓度测定方法的比较

曹 昭,万 敏,孙陆果,胡小平,于永利,王丽颖,张培因*

(吉林大学白求恩医学院1.分子生物学教研室;2.免疫学教研室,吉林 长春 130021)

两种尿素浓度测定方法的比较

曹 昭1,万 敏1,孙陆果1,胡小平1,于永利2,王丽颖1,张培因1*

(吉林大学白求恩医学院1.分子生物学教研室;2.免疫学教研室,吉林 长春 130021)

*通讯作者

血清尿素作为临床检测肾小球滤过功能的一项指标被广泛应用,目前主要测定方法有尿素酶速率法、尿素酶电极法[1]、二乙酰一肟法[2]和流动注射分析法[3]等,其中二乙酰一肟法应用最为广泛,但具有线性范围窄、反应时间长、易褪色和影响因素多等的缺点。为了克服这些不足,建立了一种快捷、方便的尿素检测方法-对对二甲基氨基苯甲醛显色法[4],其原理是对二甲基氨基苯甲醛可以与尿素反应生成带柠檬黄绿色的物质,颜色的与一定浓度范围的尿素呈线性相关。此外,该反应的最佳反应温度25℃,显色时间5 min就达到稳定,即可进行比色测定。通过对两种不同方法的测定结果比较,探讨对二甲基氨基苯甲醛显色法代替二乙酰一肟法,作为尿素含量测定方法的可行性。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 722型分光光度计。100 mmol/L尿素标准液;179.9 mmol/L二乙酰一肟溶液;显色剂:二甲基氨基苯甲醛0.2 g,溶于9 ml无水乙醇后,加入1 ml浓盐酸。酸性试剂:离子水约 100 ml,然后加入浓硫酸44 ml、85%磷酸66 ml。冷至室温后,加入氨基硫脲50 mg及硫酸镉2 g,溶解后稀释至1 L。

1.2 方法

二乙酰一肟法 取尿素标准液在0-25 mmol/L范围内,从高到底稀释为5个浓度后,分别取0.01 ml加入各试管中后,加入5 ml酸性试剂和0.5ml二乙酰一肟溶液,混匀,置沸水浴加热12 min,取出置冷水中冷却5 min,以超纯水调零,测定A540吸收测定值,做出标准曲线,计算样品的尿素浓度。

对二甲基氨基苯甲醛显色法 取尿素标准液在0～70 mmol/L范围内,从高到底稀释为稀释为7个浓度,分别取0.5 ml加入各试管中后,加入5.25 ml超纯水和0.5 ml显色液。以超纯水调零,测定A420吸收值,做出标准曲线,计算样品的尿素浓度。

2 结果

2.1 标准曲线及线性方程

取浓度为100 mmol/L的尿素标准液,用超纯水稀释成各种不同浓度的样品,用两种方法分别按浓度从低到高、在从高到低的顺序测定两次后取平均值,将理论值(Y)与测定值(X)作线性回归分析,二乙酰一肟法和对二甲基氨基苯甲醛显色法分别在尿素溶液浓度为1 mmol/L-25 mmol/L和1 mmol/L-70 mmol/L范围内符合郎伯-比尔定律,其回归曲线见图1,线性方程见表1。

图1 标准曲线和线性范围

表1 两种方法的线性实验结果

2.2 精密度对比试验

取3个不同浓度的尿素溶液,分别用二乙酰一肟法和对二甲基氨基苯甲醛显色法重复测定7次后,取平均值进行计算,其相对标准差分别为1.00-2.12、0.98-2.80,两种方法对同一样品的测定结果,经统计学分析,P＞0.05,无统计学意义,见表2。

表2 两种测定方法的精密度对比(n=7)

2.3 回收率对比试验

取3个不同浓度的尿素溶液,分别加入5 mmol/L尿素标准液,用二乙酰一肟法和对二甲基氨基苯甲醛显色法重复测定7次后,取平均值进行计算,其回归率分别为 98.3%-102.4%和 99.2%-102.3%,见表3。

表3 两种测定方法的回收率对比(n=7)

3 讨论

本研究结果显示,二乙酰一肟法和对二甲基氨基苯甲醛显色法测对同一尿素样品连续测定,其回收率分别为98.3%-102.4%和99.2%-102.3%,结果无统计学差异,但对二甲基氨基苯甲醛显色法的测定范围大于二乙酰一肟法。二乙酰一肟法是应用最为广泛,需要设备简单,容易实现,但需要加热及冷却,尤其是在标本数量多时,加热开始难以达到100℃,各管间受热温度也可能不一致,而且具有线性范围窄、反应时间长、易褪色等缺点(每小时小于5%)。为了克服这些缺点,研究者们[5-8]进行了诸多的改进,以提高其线性范围、减少褪色,但均不能彻底解决。本室建立对二甲基氨基苯甲醛显色法,与二乙酰一肟法比较,该方法检试剂单一、操作简单、显色时间短且稳定、线性范围大、准确度高、精密度好,方法标准曲线线性关系良好,不需要特殊设备,能满足检测工作的要求,适应于基础实验室及相关部门的常规检测。

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[2]孙 兰,胡毅志,胡国媛.游游池水总尿素的测定-二乙酰一肟-硫氨脲分光光度计法[J].环境与健康杂志,1995,12(4):176.

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1007-4287(2010)01-0135-02

曹昭(1979-),男,博士,从事重组蛋白质的表达、纯化及功能研究。

2009-01-26)