慢性应激致肠易激综合征大鼠模型的建立与评价

樊江波，畅洪昇，董世芬，闫兴丽，王晶，洪缨

(北京中医药大学中药学院，北京 100102)

研究报告

慢性应激致肠易激综合征大鼠模型的建立与评价

樊江波，畅洪昇，董世芬，闫兴丽，王晶，洪缨

(北京中医药大学中药学院，北京 100102)

目的建立一种模拟肠易激综合征临床症状的动物模型，为相关药物的研究提供实验基础。方法采用孤养附加慢性不可预见性刺激建立IBS模型，每只大鼠受到的刺激因子包括:24 h禁水、24 h禁食、昼夜颠倒、4℃冰水游泳15 min、45℃高温5 min、钳尾致痛1 min、束缚制动5～8 h、高速震荡15 min等共8种，每种刺激因子出现5次，共40 d。用腹部回撤反射压力阈值(AWR)和排便粒数检测动物的内脏感觉和胃肠运动功能变化;用敞箱行为评分和蔗糖水偏嗜度评价动物神经精神活动变化。结果造模2～3周腹部回撤反射压力阈值明显降低，排便粒数明显增加;造模3～4周模型组动物敞箱实验行为评分和蔗糖水偏嗜度明显降低。造模40 d时，上述变化趋势仍存在。结论慢性应激加孤养可诱导动物胃肠运动亢进、内脏感觉致敏和神经精神活动的改变，模拟IBS患者的临床特征，可作为一种有效的IBS动物模型，用于评价相关药物。

肠易激综合征;慢性应激;胃肠运动;内脏感觉;神经精神活动;大鼠

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种以腹痛或腹部不适症状为主，伴有大便性状和排便习惯改变的功能性胃肠疾病，胃肠道运动异常和内脏敏感性增高是其重要病理生理特征［1］。但由于该病缺乏特征性的生化和形态学鉴别标准，使得其病因、发病机制及相关药物的研究受到一定限制。近年来发现，IBS患者存在着明显的精神心理障碍，主要以抑郁、焦虑及躯体化表现为主，而且IBS患者的腹胀、腹痛、排便次数和性状的改变等症状与精神情绪的变化密切相关。而抗抑郁药物如氟西丁等可明显改善IBS患者的消化道症状，显示IBS是一种典型的身心疾病［2］。目前已经明确，应激刺激可导致情绪及精神状态的变化，是导致抑郁症发生的重要原因之一，同时有研究表明，应激刺激可以改变结肠和小肠运动，并且可以增加内脏感觉的敏感性，提示其在功能性胃肠疾病发病过程中同样起重要的作用［3］。

本研究通过给予大鼠不可预见性的慢性应激刺激，观察动物胃肠道功能的变化和神经精神活动的变化，目的在于建立一种模拟临床IBS患者症状的大鼠模型，为进一步研究IBS的发病机制和相关药物提供基础。

1 材料与方法

1.1 动物

SD大鼠，体质量160～180 g，雄性。北京维通利华实验动物技术有限公司提供【SCXK(京)2002－0003】。动物于(20±2)℃，湿度60%～70%，12 h明暗的环境中适应性饲养3 d后开始实验。

1.2 主要仪器和试剂

Maclab/400生物信号记录仪，澳大利亚;WZB－50微量注射泵，长沙健源医疗器械有限公司;热烘箱，上海树立仪表有限公司;振荡器，哈尔滨市东明医疗仪器厂;橡胶气囊(直径1 cm，长度2 cm)，北京萍琴乳胶制品加工厂;大鼠透明有机玻璃固定盒(20 cm×6 cm×8 cm)为自制。乙醚:北京北化精细化学品有限责任公司提供，批号:060526。

1.3 方法

1.3.1 模型制备:动物随机分为对照组与模型组。对照组大鼠每笼7～8只，常规饲养。模型组大鼠每笼单只孤养，并参照文献［4］施加以慢性不可预见性的刺激。刺激因子包括:禁水、禁食、昼夜颠倒、冷刺激、热刺激、致痛、制动、高速震荡等8种。每只动物连续遭受上述刺激共40 d，每种刺激各出现5次，刺激因子种类在40 d内随机安排，每日一种，每种刺激不连续出现5次，使动物不能预料刺激的发生。对照组不予任何刺激。

应激操作方法:①禁水:24 h断水。②禁食:24 h断食。③昼夜颠倒:于早7时将动物放入暗室中，不开灯使动物处于黑暗状态;至晚7时将暗室照明灯打开，使动物处于光照状态，至次日早7时取出。④冷刺激:将动物置于盛有4℃冰水的桶中(水深15 cm)，5 m in后取出。⑤热刺激:将动物置于45℃的烘箱中5 m in。⑥致痛:将动物放入固定笼中，露出尾部，用止血钳夹住距尾尖1 cm处(力度使动物发出哀叫声即可)持续1 min。⑦制动:将动物置于固定笼中，使其四肢头部不能随意摆动。第一次制动束缚5 h，以后时间依次递增1 h。⑧高速震荡:将动物放入振荡器中，高速水平震荡(110次/分)15 min后取出。

1.3.2 腹部回撤反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)压力阈值测定［5］:将橡胶气囊与塑料导管(直径2 mm)相连，并用0号手术线扎紧。如图1(封二)所示，将导管、微量注射泵和压力换能器分别与三通管相连接，使管路密闭不漏气，用Maclab记录压力变化曲线。

进行测定前，大鼠禁食12 h，乙醚麻醉后，将气囊由肛门插入约6 cm。固定导管与大鼠尾部，防止气囊滑出。将大鼠置入透明有机玻璃固定盒中，待其苏醒后适应30 min，用微量注射泵对气囊恒速注气加压，速度为20 m L/m in。同时观察大鼠行为，如图2(封二)所示，当大鼠出现腹部肌肉收缩时，标记此时所示压力为疼痛压力阈值。持续加压，当大鼠出现身体呈弓形，盆骨抬起时，标记其压力为最大耐受压力阈值。分别测定造模前后每只大鼠腹部回撤反射(AWR)压力阈值。

1.3.3 排便测定:动物置于代谢笼中，测定各组大鼠2 h内排便粒数。

1.3.4 敞箱实验(open－field test):所用敞箱高40 cm，长宽均为80 cm，周壁为黑色，白色地面用黑线划分为面积相等的25块，敞箱中央上方1 m处悬挂1只100 W灯泡［5］。实验在黑暗、安静的房间中进行。将单只大鼠置于清洁敞箱中央，测定动物穿越地面方块数作为水平运动得分，以站立次数为垂直运动得分。

1.3.5 糖水消耗实验:首先对动物进行蔗糖水饮用训练:在隔噪音、安静的房间内，每笼同时放置2个水瓶，第1个24 h，两瓶均装有1%蔗糖水。随后的24 h，1个瓶装有1%蔗糖水，1个瓶装纯净水。随后将动物禁食禁水，24 h后进行基础糖水/纯水消耗实验:同时给予每只大鼠事先定量好的两瓶水:1瓶1%蔗糖水，1瓶纯水。4 h后，分别测定糖水和纯水的消耗量，按下式计算动物的糖水偏嗜度，比较造模前后蔗糖水偏嗜度的变化［6］。

糖水偏嗜度=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%。

1.4 统计方法

2 结果

2.1 慢性应激刺激对大鼠AWR压力阈值的影响

AWR压力阈值反映内脏感觉状态。给予应激刺激前，模型组动物的AWR阈值，包括疼痛压力阈值及最大耐受压力阈值与正常对照组比较均无统计学差异。

给予应激刺激后，大鼠AWR阈值降低，表明动物的内脏敏感性提高。其中在给予应激刺激后10 d及20 d时，模型组动物的疼痛压力阈值和最大耐受压力阈值降低，且与对照组相比具有统计学差异(P＜0.05)。在应激30 d、40 d时，模型组动物疼痛压力阈值及最大耐受压力阈值仍然处于较低水平，但与对照组相比无差异。如表1、2所示。

表1 慢性应激对大鼠疼痛压力阈值的影响(±s，n=15)Tab.1 Changes of pain pressure threshold in the rats induced by chronic stress

表1 慢性应激对大鼠疼痛压力阈值的影响(±s，n=15)Tab.1 Changes of pain pressure threshold in the rats induced by chronic stress

注:与模型组比较，**P＜0.01，差异有显著性。Note:**P＜0.01 highly significant difference;cs:chronic stress.

组别Group疼痛压力阈值(mmHg)Pressure threshold of pain sensation造模前Pre－cs 10 d d10 post－cs 20 d d20 post－cs 32 d d32 post－cs 40 d d40 post－cs对照Control 31.64±9.03 35.58±11.86**34.4±8.95**41.23±12.15 40.61±9.12模型Model 31.27±7.11 24.59±3.97 24.63±3.72 36.15±10.49 32.87±9.47

表2 慢性应激对大鼠最大耐受压力阈值的影响(±s，n=15)Tab.2 Changes of tolerant pressure in the rats induced by chronic stress

表2 慢性应激对大鼠最大耐受压力阈值的影响(±s，n=15)Tab.2 Changes of tolerant pressure in the rats induced by chronic stress

注:与模型组比较，*P＜0.05差异有显著性。Note:*P＜0.05 significant difference vs.model group;cs:chronic stress.

组别Group最大耐受压力阈值(mmHg)Tolerant pressure造模前Pre－cs 10 d d10 post－cs 20 d d20 post－cs 32 d d32 post－cs 40 d d40 post－cs对照Control 49.01±12.44 49.11±12.73*49.64±10.74*58.95±13.85 57.04±9.05模型Model 49.05±8.65 39.4±8.24 40.03±6.12 53.08±11.14 51.85±11.68

2.2 慢性应激刺激对大鼠排便的影响

给予应激刺激后，模型组大鼠排便数量明显增加，其中应激后7 d、15 d、24 d、29 d时，与对照组比较差异明显(P＜0.05)。在应激40d时，模型组动物排便仍多于对照组，但统计学差异不明显。如表3所示。

表3 慢性应激对大鼠排便的影响(±s，n=15) Tab.3 Effect of chronic stress on defecation of the rats

表3 慢性应激对大鼠排便的影响(±s，n=15) Tab.3 Effect of chronic stress on defecation of the rats

注:与模型组比较，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05，差异有显著性。Note:***P＜0.001 very significant difference，**P＜0.01 highly significant difference，*P＜0.05 significant difference vs.model group;cs:chronic stress.

组别Group粪便粒数(粒数/2 h)Amount of feces granules(n/2 h) 7 d d7 post－cs 15 d d15 post－cs 24 d d24 post－cs 29 d d29 post－cs 40 d d40 post－cs对照Control 2.86±3.64**2.14±2.03***2.80±2.64*0.50±1.38*1.75±1.92模型Model 7.33±4.25 9.33±2.89 5.09±2.11 2.71±2.86 2.36±2.74

2.3 慢性应激刺激对大鼠敞箱行为评分的影响

给予应激刺激后的早期(9 d和18 d)，模型组动物敞箱行为评分(包括水平运动得分和垂直运动得分)比对照组略有增高，但二者间没有统计学差异。至应激27 d时，模型组动物敞箱行为评分显著低于对照组(P＜0.05)。至应激40 d时，这种降低的趋势仍然存在。如表4所示。

2.4 慢性应激对大鼠蔗糖水偏嗜度的影响

给予大鼠慢性应激刺激，可导致其兴趣缺失，表现为模型组动物蔗糖水偏嗜度降低，其中造模20d时，模型组与对照组相比差异有显著性(P＜0.05)，如表5所示。

表4 慢性应激对大鼠敞箱行为评分的影响(±s，n=15)Tab.4 Effect of chronic stress on the scores of open－field test in the rats

表4 慢性应激对大鼠敞箱行为评分的影响(±s，n=15)Tab.4 Effect of chronic stress on the scores of open－field test in the rats

注:与模型组比较，*P＜0.05差异有显著性。Note:*P＜0.05 significant difference vs.model group;cs:chronic stress.

组别Group水平运动得分Horizontal movement activity score垂直运动得分Vertical movement activity score 9 d d9 post－cs 18 d d18 post－cs 27 d d27 post－cs 40 d d40 post－cs 9 d d9 post－cs 18 d d18 post－cs 27 d d27 post－cs 40 d d40 post－cs对照Control 40.67±19.94 6.90±7.53 26.78±19.55*29.75±19.14 7.17±4.53 1.93±2.43 6.27±5.29*4.54±2.22*模型Model 43.46±22.73 8.45±9.16 9.00±9.27 15.00±9.03 7.38±5.19 2.80±5.28 2.42±2.64 2.27±2.28

表5 慢性应激对大鼠蔗糖水偏嗜度的影响(±s，n=15)Tab.5 Effect of chronic stress on the preference for sucrose water in the rats

表5 慢性应激对大鼠蔗糖水偏嗜度的影响(±s，n=15)Tab.5 Effect of chronic stress on the preference for sucrose water in the rats

注:与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05差异有显著性。Note:*P＜0.05 significant difference vs.model group;cs:chronic stress.

组别Group蔗糖水偏嗜度Sucrose water preference(%)造模前Pre－cs 10 d d10 post－cs 20 d d20 post－cs 30 d d30 post－cs 40 d d40 post－cs对照Control 80.69±10.12 81.93±11.95 86.81±6.47*80.02±16.44 89.81±8.09模型Model 80.81±9.76 71.08±19.42 69.59±20.24 70.73±25.51 79.54±17.45

3 讨论

IBS的发生与遗传、早期生活经历、感染、肠道菌群失调及食物等多种因素有关，其发病机制尚未完全阐明。现有的实验动物模型主要是模拟IBS某些病理生理学特征，如腹泻或便秘、疼痛等，或模拟某些致病因素建立动物模型，如模拟遗传因素致病的转基因动物模型、模拟早期生活经历致病的幼鼠母子分离孤养模型或幼鼠直肠扩张模型等，但转基因动物价格昂贵且不易获得，幼鼠模型造模时间长且实验条件要求高、耗费大，均不宜用于大量药物筛选。其他IBS动物模型如肠道感染模型、化学刺激诱导肠道炎症模型以及药物(如促肾上腺皮质激素释放因子，CRF)诱导的胃肠运动紊乱模型等，但这些诱发因素或条件刺激均与IBS发病的自然危险因素有较大差距［7～10］。因此建立与IBS自然发病因素更加吻合、更全面、准确再现IBS病理生理学特征，且操作简便、经济适用的动物模型对于研究IBS的发病机制和相关药物具有实际应用意义。

胃肠功能异常是IBS患者的主要临床特征，在此基础上，IBS患者还存在着明显的精神心理的异常。研究调查发现，97.1%的IBS患者存在不同程度的心理问题。其中中度以上异常的有77.9%，重度异常的有57.4%［11］。因此IBS被认为是一种伴有神经精神异常和胃肠道功能改变的生理心理疾病。

应激反应在IBS发生或加重过程中具有重要作用。病理性应激刺激可以激活中枢情感活动系统(emotion motor system，EMS)。EMS为中枢系统的一个网络机构，主要包括下丘脑室旁核、杏仁核、水管周围灰质，接受从内脏和躯体以及从皮质传入的刺激信号，经过信号整合后通过垂体和脑桥延髓核对自主神经系统的输出、神经内分泌以及内脏感觉进行调节，产生胃肠道生理和病理征状，例如IBS的形成。与此同时应激刺激又可导致焦虑、抑郁等精神异常［12］。

本研究对大鼠施以慢性不可预见性的应激刺激，以单位时间内的动物排便粒数反映其胃肠道运动功能，以腹部回撤反应(AWR)压力阈值反映动物内脏敏感状态，二者共同评价慢性应激刺激对动物胃肠道功能的影响。同时通过敞箱实验和蔗糖水偏嗜度实验评价动物神经精神活动的改变，目的建立与临床IBS患者症状相符的动物模型。

实验结果显示，给予大鼠慢性应激刺激后，模型组动物的AWR压力阈值(疼痛压力阈值和最大耐受压力阈值)与对照组相比均明显降低，表明应激刺激导致了动物内脏感觉的增敏。这种变化在给予应激刺激第10天及第20天时即可明显显现，至第32天和第40天时，模型组动物的AWR压力阈值仍保持低水平趋势。排便实验结果显示，模型组动物排便粒数比对照组明显增加，第7天时即与对照组有显著差异，并持续至第29天，第40天时，模型组动物的排便数量虽仍高于对照组，但无统计学差异。上述结果显示应激刺激所致内脏感觉增敏和胃肠运动亢进与IBS患者出现的腹痛、腹部不适感觉及排便异常等临床症状相吻合，且这种变化在遭受应激刺激的中早期(2～3周)表现明显。

敞箱活动评分减少表明动物的探究能力或者好奇心理下降，蔗糖水偏嗜度降低反映动物快感缺失［5］。本实验结果显示给予大鼠慢性应激刺激后，模型组动物敞箱实验的水平运动得分与垂直运动得分均显著降低，蔗糖水偏嗜度也明显降低，所反映出的活动能力下降、兴趣丧失现象与临床IBS患者的抑郁样精神状态相似，且这种变化在遭受应激刺激3～4周时表现明显。

综上所述，给大鼠施予慢性不可预见性的应激刺激导致其出现胃肠运动亢进、内脏感觉增敏以及抑郁样等状态，与临床上IBS患者的发病原因及症状表现相似。与现有动物模型相比，本模型的致病因素与现实社会IBS患者的自然致病因素更加吻合，且具有操作简便、实验周期短、经济易行等特点，可用于研究IBS的发病机制以及评价和观察相关药物的作用。

(本文图1，2见封二。)

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Establishm ent and Evaluation of a Novel Rat M odel of Chronic Stress-Induced Irritable Bowel Synd rom e

FAN Jiang－bo，CHANG Hong－sheng，DONG Shi－fen，YAN Xing－li，WANG Jing，HONG Ying
(School of Traditional Chinese Pharmaceutics，Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100102，China)

ObjectiveTo establish a novel rat model of irritable bowel syndrome(IBS)by exposing to chronic unpredictable stressors.M ethods Thirty male SD rats were used in this study.The rats were exposed to chronic unpredictable stress with additional individual housing to induce IBS symptom.The stress factors include:drink prohibition，fasting for 24 hours，day and night reversal，cold，heat，pain，arrest and swing.Visceral sensation was assessed by pressure threshold of abdominal withdrawal reflex(AWR)，gastrointestinal motility was assessed by counting the feces granules.open－field test and fluid consumption test were performed to assess the neuropsychic function.Results Compared with the control rats，at 2 or 3 weeks post exposure，the visceral sensation and gastrointestinal motility of the model rats increased evidenced as the increased amount of faces granules and decreased pressure threshold of AWR.At 3 or 4 weeks post exposure，the scores of open－field test and the preference for sucrose solution was significantly reduced in the model rats as compared with those of the control rats.On the day 40 post exposure，all the above mentioned change trend still could be observed in the model group rats，but without statistical significance compared with those of the control rats..ConlusionBy exposing to the chronic unpredictable stress with additional individual housing，rats show the following changes:enhanced gastrointestinal motility，visceral sensation and changes of neuropsychic function，which are quite similar to the symptom of IBS patients，and may be used in related research in future.

Irritable bowel syndrome;Chronic unpredictable stress;Gastrointestinal motility;Visceral sensation; Neuropsychic function;Rat

R33

A

1005－4847(2010)02－0091－05

2009－09－23

国家自然科学基金项目(30572463);北京市重点实验室(JD100260652)。

樊江波(1983－)，男，北京中医药大学硕士研究生，研究方向:中药药理学。现工作于国家知识产权局专利局。

洪缨，Tel:010－84738626，E－mail:yinghong2000@sina.com